一、背景
腦膜炎敗血金黃桿菌PCR試劑盒采用SYBR Green染料法實時熒光PCR技術，針對腦膜炎敗血金黃桿菌的基因高度保守區(qū)域設計特異性引物，用熒光PCR技術對腦膜炎敗血金黃桿菌的核酸進行體外擴增檢測，在反應體系中含腦膜炎敗血金黃桿菌核酸模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號，利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現檢測結果的定性、定量分析。
二、腦膜炎敗血金黃桿菌PCR試劑盒使用方法
1、樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
按照試劑盒操作說明或者臨床樣品處理方法做好樣品前處理。
1.2 DNA提取
根據您實驗室的具體情況和樣品類型，選擇適當的提取策略方法。為了使實驗結果穩(wěn)定、有效、可靠，我們建議使用商品化的試劑盒進行提取，嚴格按照對應試劑盒說明書進行操作，樣本核酸提取過程中應避免污染，提取好的模板樣品如不能立即檢測，建議-15℃以下保存。推薦采用我們公司研發(fā)生產的試劑盒：細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱法)
2、試劑配制（試劑準備區(qū)）
2.1從-15℃以下冰箱中取出試劑盒平衡到室溫（20～25℃），注意避免強光照射，待完全溶解后振蕩混勻并低速離心10 s，使用低吸附吸頭分液取樣，避免試劑損失和浪費。
2.2根據待檢測樣本總數，設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配制1份)。
2.3在適當容積的無菌離心管中加入上述試劑，充分振蕩混勻后2000 rpm離心10 s，按照20μL/管分裝量將試劑分裝至八聯(lián)PCR反應管中。
2.4蓋緊八聯(lián)PCR反應管蓋,并注意做好相應標識（請標記在八聯(lián)PCR反應管蓋兩端突出部位，切勿標記在八聯(lián)PCR反應管蓋中間）。將PCR反應管轉移至樣本準備區(qū)，剩余試劑放回-15℃以下冰箱冷凍保存。
3、加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟1提取的DNA、陽性質控品、陰性質控品各取5μL，加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心，核酸加樣過程中應避免污染。
4、PCR擴增（核酸擴增區(qū)）
4.1將待檢測反應管置于熒光定量PCR儀反應槽內。
4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為25μL。
熒光通道選擇：檢測通道熒光染料法(SYBR Green I)，淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI系列儀器請勿選擇ROX參比熒光，選擇None即可。
4.3按照腦膜炎敗血金黃桿菌PCR試劑盒說明書設置循環(huán)參數
5、腦膜炎敗血金黃桿菌PCR試劑盒結果分析判定
5.1結果分析條件設定
設置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內調節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內調節(jié))，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.2結果判斷
陽性：檢測通道Ct值≤35.0，且曲線有明顯的指數增長曲線。
可疑：檢測通道Ct值>35.0，且出現典型擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果出現Ct值≤38.0和典型擴增曲線者為陽性，否則為陰性。
陰性：檢測結果Ct值無Ct值，無明顯的擴增曲線。
三、應用
腦膜炎敗血金黃桿菌PCR試劑盒可以用于金黃桿菌臨床分離株耐藥性分析及β-內酰胺酶基因型研究：
1、了解臨床分離金黃桿菌對常用抗菌藥物的耐藥特性;
2、了解金黃桿菌β-內酰胺酶產生情況;
3、研究金黃桿菌β-內酰胺酶基因型及分布情況。
材料與方法：菌株來源共收集金黃桿菌52株,其中主要為產吲哚黃桿菌和腦膜膿毒性金桿菌,分別為25株和23株。質控菌株大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC700603、陰溝腸桿菌029M、接合試驗受體菌E.coli C600和銅綠假單胞菌pa119均為本科保存菌株。
方法：瓊脂稀釋法測定18種藥物對52株金黃桿菌的最低抑菌濃度,三紙片增效法、改良三維試驗法進行金黃桿菌產β-內酰胺酶表型篩查,PCR方法和全編碼基因分析β-內酰胺酶基因型,接合轉移試驗和質粒DNA的檢測了解β-內酰胺酶基因是否具有可轉移性,等電聚焦電泳測定β-內酰胺酶的pI值。
結果：52株金黃桿菌對碳青霉烯類藥物亞胺培南、美羅培南的耐藥率為73.1%,氨曲南為90.4%,阿米卡星和β-內酰胺抗生素的耐藥率均大于40%。喹諾酮類藥物加替沙星、左氧氟沙星耐藥率為11.5%、9.6%,以及利福平8.7%,均表現出很強的抗菌活性。
金黃桿菌β-內酰胺酶檢測結果,25株產吲哚黃桿菌的表型和PCR方法分別檢測出MBLs 19株和20株,基因型以bla IND-1和bla IND-2為主,分別為9株和10株,菌株C-15攜帶bla IND-1,MBLs表型檢測及β-內酰胺酶初篩均為陰性。
14株腦膜膿毒性金桿菌表型和PCR方法分別檢測出MBLs 17株,基因型為blaB1,2株;blaB2,5株;blaB3,4株;blaB11,4株;blaGOB-1,1株;blaGOB-10,1株。僅7株細菌檢出產ESBLs,均為腦膜膿毒性金桿菌,基因型為3株blaCME-1和4株blaCME-2,其中5株細菌同時檢出MBLs。52株細菌均未檢出產AmpC酶。攜帶β-內酰胺酶基因的金黃桿菌接合試驗均未成功。質粒DNA均未檢出β-內酰胺酶基因。
結論：
1、金黃桿菌多重耐藥現象嚴重,對碳青霉烯類等多種抗菌藥物呈高度耐藥;
2、腦膜膿毒性金桿菌具有較高的ESBLs和MBLs攜帶率,基因型分別以blaCME和blaB為主,可同時攜帶兩種MBLs基因,且blaCME常和MBLs基因同時攜帶;
3、產吲哚黃桿菌具有很高的MBLs檢出率,本地區(qū)攜帶的MBLs基因型以bla IND-1和bla IND-2為主。
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