一、背景
犬皰疹病毒PCR試劑盒是一種用于快速檢測和定量犬皰疹病毒的分子生物學檢測試劑盒。
該試劑盒采用聚合酶鏈式反應（PCR）技術，通過一對引物介導，可以在動植物體外對特定基因（DNA）片段進行快速酶促擴增。經過n個熱循環(huán)擴增后，擴增產物中所含特定基因數(shù)是原始模板數(shù)的(1+E)n倍，使得檢測擴增產物中的特定基因成為可能。
犬皰疹病毒PCR試劑盒具有特異性強、靈敏度高、快速高效等優(yōu)點。該試劑盒的特異性取決于引物與模板DNA的特異正確結合以及堿基配對原則等。
此外，該試劑盒是針對犬皰疹病毒設計的，因此在其他動物或環(huán)境中檢測到的結果可能不準確。
二、犬皰疹病毒PCR試劑盒實驗操作
1、模板制備（樣本制備區(qū)）
建議使用配套水生動物病害基因組DNA/RNA提取試劑盒系列產品，具體過程詳見產品說明書。
2、添加模板（模板添加區(qū)，放置于冰盒中進行）
請于-20℃條件下保存，有效期12個月
取出所需測試數(shù)的已含有反應液A-TSV-I的PCR管，將試劑完全解凍，離心30秒，在管蓋上標記管名（陰性對照管NG、樣品XX、陽性對照管PG）。打開管蓋向各管管底分別加入0.8μL B-I及0.2μL R-I，蓋上陰性對照管管蓋，其他各管分別沿管壁加入2μL模板，順序為待測樣品模板、PG-TSV-I，依次蓋好各管管蓋，離心30秒，立即進行擴增反應。
3、擴增反應（擴增及產物分析區(qū)）
①恒溫儀器63℃條件下反應60 min。待儀器升溫至63℃后，新建程序，設置實驗名稱及反應時間，將步驟2中離心后的PCR反應管放入恒溫熒光分子檢測儀，點擊開始檢測。
②若使用熒光定量PCR儀，則熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇None，將63℃15 s，63℃45 s作為一個循環(huán)，于63℃45 s處收集熒光信號，60個循環(huán)。
其他儀器請參照儀器說明書進行設置。
三、應用
犬皰疹病毒PCR試劑盒可以用于犬皰疹病毒的分離鑒定及US6基因的生物信息學分析：
犬皰疹病毒(Canine herpesvirus,CHV)感染僅存在于犬中,是新生幼犬的急性、非發(fā)熱型致死性疾病。由US6基因編碼的gD糖蛋白是皰疹病毒囊膜上的重要組成部分,它具有識別各自紅細胞的能力,使各個皰疹病毒都有自己的特征。因此,本研究根據(jù)自然發(fā)病犬的臨床癥狀、聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)、病毒的分離和純化、動物回歸實驗和基因生物信息學分析的實驗手段證實了該疾病為CHV感染所致,另外,對US6基因編碼的gD糖蛋白的主要抗原區(qū)域進行分析并構建了表達載體。
試驗結果如下：
1、從病犬肝臟中提取的DNA經PCR擴增,檢測出大小為357 bp的目的條帶,經NCBI的Blast比對驗證該病毒為CHV,毒株命名為CHV-JX株,并測得該病毒的TCID50為10-4.39/0.1mL;該病毒感染的犬腎細胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)在電鏡下可看到圓形的病毒粒子,細胞出現(xiàn)了空泡化;在顯微鏡下,可以看到24h內細胞開始出現(xiàn)圓縮、變暗,逐漸向周圍擴散,最后細胞脫落。將CHV-JX毒株接種到15日齡的幼犬,腹部皮膚可見皰疹,解剖見腎臟出現(xiàn)壞死灶等典型性的皰疹病毒臨床癥狀和病理變化。
2、與對照組相比,除24h組外,48h和96h組細胞的凋亡率顯著升高(P<0.05);與對照組相比,細胞線粒體膜電位在第24h、48h和96h時均極顯著升高(P<0.01);與對照組相比,細胞的ROS在24h時先升高,48h,72h,96h時下降;與對照組相比,除24h組外,其他組細胞的pH均下降。
3、經PCR擴增得到條帶(大小為1200 bp左右)的US6全基因與國內外CHV毒株的US6基因進行同源性分析,與澳大利亞、英國和美國犬CHV的核苷酸同源性結果高達99.9%,同時氨基酸同源性為100%,然而它與非犬源CHV毒株的同源率很低。DNA序列分析得出該基因編碼346個氨基酸,使用全基因合成的方法合成該基因片段,并克隆到表達載體pET32a(+)上,成功構建了重組質粒CHV-3F-3R。獲得的犬源皰疹病毒CHV-JX感染犬后,生殖器官周圍可見典型的皰疹病毒臨床癥狀;CHV-JX感染MDCK后可導致細胞的凋亡;同時成功構建了該病毒US6基因的主要抗原區(qū)域的重組質粒。
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