一、背景
細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒適用于快速提取各種細(xì)菌基因組DNA。采用獨(dú)特的結(jié)合液/蛋白酶K迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞內(nèi)核酸酶，然后基因組DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。本試劑盒也可用于食品致病菌(微生物)基因組提取，如：金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、出血性大腸桿菌O157：H7、單增李斯特、沙門氏菌、阪崎腸肝菌等?？蓮?-5 ml細(xì)菌培養(yǎng)液中，快速提取純化10-40μg純凈的基因組DNA，所得基因組DNA可直接用作PCR模板、酶切、雜交等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
二、操作步驟
使用前請(qǐng)先在緩沖液GD和漂洗液PW中加入無水乙醇，加入體積請(qǐng)參照瓶上的標(biāo)簽。
1、取細(xì)菌培養(yǎng)液1-5 ml，10,000 rpm(~11,500×g)離心1 min，盡量吸凈上清。
2、向菌體沉淀中加入200μl緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸浮。
注意：對(duì)于較難破壁的革蘭氏陽性菌，可略過第2步驟，加入溶菌酶溶液進(jìn)行破壁處理，具體方法為：加入110μl緩沖液（20 mM Tris,pH 8.0；2 mM Na2-EDTA；1.2%Triton），和70μl溶菌酶溶液（50 mg/ml，客戶自備，目錄號(hào)：RT401），37℃處理30min以上。如果需要去除RNA，可加入4μl RNase A（100 mg/ml）溶液，振蕩15 sec，室溫放置5 min。
3、向管中加入20μl Proteinase K溶液，混勻。
4、加入220μl緩沖液GB，振蕩15 sec，70℃放置10 min，溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
5、加220μl無水乙醇，充分振蕩混勻15 sec，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
6、將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm(~13,400×g)離心30 sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
7、向吸附柱CB3中加入500μl緩沖液GD（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm(~13,400×g)離心30 sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
8、向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm(~13,400×g)離心30 sec，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中。
9、重復(fù)操作步驟8。
10、將吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm(~13,400×g)離心2 min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
11、將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μl洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5 min，12,000 rpm(~13,400×g)離心2 min，將溶液收集到離心管中。
三、應(yīng)用
用于禽多殺性巴氏桿菌基因組重測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組分析及其毒力基因鑒定研究：
以禽源多殺性巴氏桿菌強(qiáng)毒株P(guān)mC48-1株、Pm72-4株和弱毒株P(guān)m731株為實(shí)驗(yàn)材料,對(duì)三個(gè)菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序。
結(jié)果表明：PmC48-1株、Pm72-4株和Pm731株基因組全長(zhǎng)分別為2,304,775 bp、2,259,533 bp、2,260,636 bp,G+C%含量分別為40.38%、40.28%、40.42%,預(yù)測(cè)的基因數(shù)分別為2131、2028、2068個(gè)。
結(jié)合已公布的Pm70基因組序列,利用比較基因組學(xué)分析獲得四個(gè)菌株間的差異基因。比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn):強(qiáng)毒株P(guān)mC48-1株含有一個(gè)特有基因簇,通過與參考菌株P(guān)m70基因組比較分析發(fā)現(xiàn)該基因簇全長(zhǎng)44,468 bp,兩端含有20 bp與基因PMRS03305（rpL25）的3?端序列同源的定向重復(fù)序列,預(yù)測(cè)基因PMRS03305的3?端是這段基因簇的插入位置;利用PHAST軟件分析發(fā)現(xiàn)該基因簇包含一個(gè)完整的噬菌體序列和一個(gè)不完整的噬菌體序列,是一個(gè)噬菌體相關(guān)基因島,編碼67個(gè)Coding sequence（CDS）。
提取強(qiáng)毒株P(guān)mC48-1株、Pm72-4株和弱毒株P(guān)m731株RNA,進(jìn)行RNA-seq分析找出強(qiáng)毒株P(guān)mC48-1、Pm72-4與弱毒株P(guān)m731共同的差異表達(dá)基因,對(duì)共同差異表達(dá)基因的上調(diào)基因和下調(diào)基因分別做GO和KEGG Pathway富集分析,選取部分共同差異表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。
結(jié)果表明強(qiáng)毒株P(guān)mC48-1株和Pm72-4株與弱毒株P(guān)m731株共同差異表達(dá)基因有190個(gè),其中75個(gè)上調(diào),115個(gè)下調(diào)。GO富集分析顯示這些差異基因在分子功能方面主要涉及催化活性、結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn),在細(xì)胞組成方面主要涉及膜和細(xì)胞組成,在生物學(xué)過程方面主要參與細(xì)胞過程、代謝過程和定位。KEGG Pathway富集到的通路有碳水化合物代謝、能量代謝、氨基酸代謝、輔酶因子和維生素代謝、膜運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性等通路。選取上調(diào)基因4個(gè),下調(diào)基因8個(gè),經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證,其與RNA-seq分析結(jié)果基本一致。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證Pm強(qiáng)弱毒株的差異毒力基因,分別選取基因組學(xué)篩到的PmC48-1株噬菌體相關(guān)基因島上的6個(gè)基因（PP00004、PP00009、PP00019、PP00053、PP00060、PP00068）和轉(zhuǎn)錄組學(xué)篩到的4個(gè)上調(diào)基因（dppA、fbpA、rsgA-2、PM0472）,共計(jì)強(qiáng)弱毒株差異基因10個(gè),進(jìn)行PmC48-1株單基因突變株的構(gòu)建。通過同源重組技術(shù)篩選雙交換突變株,分析雙交換突變株的遺傳穩(wěn)定性、生長(zhǎng)特性和致病性。結(jié)果表明,成功構(gòu)建10個(gè)基因的重組替代質(zhì)粒,篩選到4個(gè)基因（PP00004、PP00009、PP00019、dppA）的雙交換突變株,分別命名為PmC48-1Δ4、PmC48-1Δ9、PmC48-1Δ19、PmC48-1ΔdppA。四個(gè)突變株連續(xù)傳代20代后其遺傳穩(wěn)定性良好,體外生長(zhǎng)曲線與野生型PmC48-1株基本一致。
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