一、背景
支原體去除試劑盒是一種混合抗生素制劑，含有三種對支原體具有抑菌作用的組分，分別是喹諾酮類、四環(huán)素衍生物類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，可取得良好的支原體清除效果。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，定期檢測能夠有效的避免支原體大量污染，但如果細(xì)胞已受支原體污染，則需對其進(jìn)行及時處理，最佳處理原則為將細(xì)胞高壓滅菌后丟棄，以免污染其它潔凈的細(xì)胞株。若受污染的細(xì)胞比較珍貴，必須去除支原體污染，可以通過混合使用抗生素以達(dá)到目的。由于支原體無細(xì)胞壁，因此傳統(tǒng)的抗生素一般對其無效。
支原體（mycoplasma）：又稱霉形體，為目前發(fā)現(xiàn)的最小的最簡單的原核生物。支原體細(xì)胞中唯一可見的細(xì)胞器是核糖體。大小一般在0.3-0.5um之間，缺乏細(xì)胞壁呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態(tài)。能通過濾菌器、可在無生命培養(yǎng)基中生長繁殖，在自然界分布極為廣泛?？蓪θ?、動物、植物、昆蟲等致病，造成極大危害。
支原體對細(xì)胞的影響，主要從兩方面考慮：一方面是對細(xì)胞的直接影響，細(xì)胞被支原體污染后，增殖緩慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁上脫落，部分細(xì)胞雖然表面變化不十分明顯，實(shí)際上潛伏著多方面的危險；另一方面，支原體可以通過消耗培養(yǎng)基中的精氨酸，抑制細(xì)胞DNA、RNA的合成，降低細(xì)胞的抵抗力。總之，支原體感染會對細(xì)胞造成的影響是多方面的：包括代謝、免疫或生化特性、生長狀況、酶的作用途徑、細(xì)胞膜的組成、染色體結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)染效率、以及細(xì)胞存活等多方面的改變。
二、應(yīng)用
用于Baytril對BHK-21細(xì)胞大腸桿菌、豬鼻支原體污染清除研究：
細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)菌和支原體污染,特別是支原體污染一直都是細(xì)胞培養(yǎng)的難題。污染了細(xì)菌和支原體的細(xì)胞,雖然一般選擇廢棄,但有些重要的細(xì)胞依然需要靠清除污染來挽救。細(xì)胞株的微生物污染源一般有細(xì)菌、真菌、支原體。細(xì)菌和真菌污染細(xì)胞培養(yǎng)物時導(dǎo)致培養(yǎng)基變色,鏡下可以看到菌體。但細(xì)胞株感染支原后培養(yǎng)基通常不會有顏色變化,更不能在普通顯微鏡下觀察到。支原體會影響培養(yǎng)細(xì)胞的各項(xiàng)參數(shù),甚至導(dǎo)致細(xì)胞株死亡。
鑒于細(xì)胞培養(yǎng)的污染清除中存在的諸多問題,本研究以BHK-21細(xì)胞、抗菌藥Baytril、大腸桿菌、豬鼻支原體為研究對象,用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,采用10倍分級稀釋法,測出抗菌藥Baytril對BHK-21細(xì)胞的最小抑制濃度為60-80PPM。用同樣方法,測出Baytril對大腸桿菌的最小抑菌濃度是1PPM。而Baytril對豬鼻支原體的最小抑菌濃度是0.5-2PPM[63],所以選定了10PPM這個即不影響B(tài)HK-21細(xì)胞,又可以抑制大腸桿菌和豬鼻支原體的Baytril濃度來做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。在細(xì)菌部分的實(shí)驗(yàn)里,用含10PPM的抗菌藥Baytril的MEM生長液,對用大腸桿菌人工污染的BHK-21細(xì)胞里,通過洗涮、沖洗、重點(diǎn)沖洗、刮出、消化、貼壁后再沖洗等循環(huán)往復(fù)的處理等辦法。
在抗菌藥Baytril的保護(hù)下,大幅度地稀釋大腸桿菌在細(xì)胞群里面的濃度,同時也在用無抗菌藥的培養(yǎng)液做大腸桿菌的監(jiān)測。監(jiān)測顯示,進(jìn)行到第4個清污循環(huán)時,BHK-21細(xì)胞里大腸桿菌的污染已經(jīng)被徹底清除。在支原體的的實(shí)驗(yàn)里,人為感染豬鼻支原體的BHK-21細(xì)胞,同樣是用含10PPMBaytril抗生素的MEM生長液,同樣采用和清除大腸桿菌基本相同的方法。
用DNA熒光染色法和PCR法對豬鼻支原體的清除進(jìn)行不斷監(jiān)測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),同樣是到了第4輪循環(huán),BHK-21細(xì)胞就脫離了支原體的污染,并且PCR法比起DNA熒光染色法要敏感得多。最后通過生物統(tǒng)計(jì)學(xué)里的配對資料符號檢驗(yàn)法檢驗(yàn)后得出,本方法對清除BHK-21細(xì)胞系中的大腸桿菌、豬鼻支原體感染具有極顯著的效果。
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