一、實驗目的
1、了解革蘭氏染色原理并掌握其操作。
2、鞏固無菌操作技術及顯微鏡使用方法。
二、實驗原理
革蘭氏染色法能將細菌分成兩大類，即革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。在用乙醇進行脫色時，兩種菌的細胞壁結構不同，陽性菌細胞壁為網(wǎng)狀結構，比較厚，結晶紫-碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內，而陰性菌細胞壁比較薄，顏色更容易洗脫出來，所以最終革蘭氏陰性菌為紅色，陽性菌為紫色。
三、儀器、試劑與材料
1、菌種：枯草芽孢桿菌和大腸埃希氏菌屬25922。
2、染色液和試劑：結晶紫、碘液、番紅、95%的乙醇、沙黃、香柏油、二甲苯、蒸餾水。
3、器材：顯微鏡、載玻片、接種環(huán)、酒精燈、擦鏡紙、滴管、吸水紙
四、實驗步驟
1、染色步驟
（1）制片：接種環(huán)蘸取細菌液置于載玻片，酒精燈外焰加熱玻片進行細菌固定。
（2）初染：添加結晶紫染色，1min后傾去染色液，蒸餾水沖洗至無色。
（3）媒染：吸干殘留蒸餾水后，加入一滴碘液，作用1min，水洗。
（4）脫色：吸干殘液后，加入95%酒精進行脫色，30s后水洗。
（5）復染：吸干殘液后，用番紅液復染，1min后，水洗。
（6）鏡檢：吸干殘液后，低倍鏡尋找目標物體，再用高倍鏡放大目標物，目標視野添加香柏油進行觀察。
2、平板劃線
（1）左手中指、無名指和小拇指托住無菌平皿。
（2）蓋子用食指和拇指掰開，右手持接種環(huán)進行第一區(qū)劃線。
（3）酒精燈灼燒接種環(huán)至通紅，晾涼后進行第二區(qū)劃線
（4）重復（3）進行第三、四區(qū)劃線
（5）將平皿置于適宜溫度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。
五、結果與討論
1、革蘭氏染色結果
圖1為顯微鏡下的染色結果，從結果可以看出，這是革蘭氏陽性菌，也就是我們所用的實驗材料之一枯草芽孢桿菌，不過紅色比較零星，這可能是因為我們
在清洗載玻片的時候不小心清洗過度，將一部分細菌沖洗掉了，所以效果并不是很好。
而我們所用的另外一個實驗材料大腸埃希氏菌屬25922理論上說應該是革蘭氏陰性菌，這也就意味著最終顯微鏡下看到的顏色應該是紫色，但是試驗最后我們只觀察到一片白色，回過頭來思考原因，這可能是因為我們在吸干載玻片的過程中用力過猛用紙巾把細菌給擦去了，所以最后細菌都沒了，也就沒有染上相應的顏色。
2、平板劃線結果
下圖為平板劃線結果，從結果看，上方的劃線是較為失敗的，菌落都堆在了一起，沒有得到足夠的單細菌菌落，而下方的劃線結果則相對理想一些，因為得到的單細菌菌落相對更多，但同時也存在很多黏在一起的菌落，這是比較失敗的一個部分，反思原因，可能是因為劃線的時候重復涂抹了太多次，搞得細菌都重疊到了一起，下次劃線的時候一定要加倍注意，努力畫出更符合標準的菌落。
3、討論：
a、革蘭氏染色的關鍵步驟是什么？為什么？
答：關鍵步驟是酒精脫色，因為若脫色過度，則陽性菌會被誤認成陰性菌（都為紫色）；脫色不足，則陰性菌會被誤認成為陽性菌（都為紅色）。
b、造成革蘭氏染色結果不正確的原因有哪些？
答：（1）細菌涂片太厚太濃使得細菌重疊，脫色效果不好會造成假陽性。（2）乙醇脫色過度造成假陰性，脫色不足造成假陽性。（3）所用細菌所處時期不對，如菌齡過老、死亡或細胞壁受損傷的陽性菌也會呈陰性反應，所以實驗過程要使用對數(shù)生長期的幼齡培養(yǎng)物。
c、劃線完畢后，平皿為什么要倒著放？
答：最主要的原因是防止空氣中的細菌沉降至瓊脂上造成污染，某些情況下也可以防止水份過多時污染菌順著側壁流進瓊脂里。此外，培養(yǎng)箱的溫度一般都比較高，而水汽的蒸發(fā)方向是向上的，因此倒置平皿不會失水過多，可以延緩干燥速度。
六、注意事項
1、細菌涂片不宜太厚，否則細菌容易重疊，影響脫色效果。
2、火焰固定不宜過熱，做到玻片不燙手背即可。
3、乙醇脫色是關鍵操作，脫色過度陽性菌會被誤染成陰性菌，脫色不足，陰性菌會被誤染成陽性菌。
4、劃線的時候要做到無菌，蓋子盡量往平皿一邊放，不要置于平皿的正上方，避免誤染等，手在進行操作時要先用酒精消毒。
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