血液基因組DNA提取試劑盒的應(yīng)用！
小楊 / 2020-09-28 08:20:36
一、背景
血液基因組DNA提取試劑盒采用可以特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱和獨特的緩沖液系統(tǒng)，提取全血基因組DNA。離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料為新型材料，能夠高效、專一吸附DNA，可最大限度去除雜質(zhì)蛋白及細胞中其他有機化合物。提取的基因組DNA片段大，純度高，質(zhì)量穩(wěn)定可靠。使用試劑盒提取的基因組DNA可用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、文庫構(gòu)建、Southern雜交等實驗。
二、使用方法
1、樣本處理（1.5 ml EP管中處理）
抗凝全血：吸取200~500μl抗凝全血加入到800 ul紅細胞裂解液中上下顛倒混合均勻，13000rpm離心30s，去上清，留細胞沉淀，用50μl水重懸細胞沉淀。
淋巴細胞分離液分離出的白細胞：直接吸取50μl白細胞。
有核紅細胞抗凝全血（禽血）：吸取5μl抗凝全血加入到50μl無菌水中，漩渦震蕩混合均勻。
2、向上述準備好的樣品溶液中加入100μl gDNA LB1和20μl蛋白酶K漩渦混合均勻10s，56℃水浴鍋中消化5min。
3、加入700μl gDNA BB2漩渦震蕩混合均勻1min，13000rpm離心3min。
4、將上清液倒入到吸附柱中，13000rpm離心1min。
5、倒掉廢液。向吸附柱中加入500μl Washing Buffer，13000rpm離心15s。重復(fù)此步驟一次。
6、將吸附柱重新放回離心機，13000rpm空離心2min，將殘留的乙醇徹底甩干。
7、將吸附柱芯放入到1.5ml收集管中，向吸附柱芯中加入60~150μl DNA Elution Buffer（DNA Elution Buffer預(yù)熱到65℃將提高洗脫產(chǎn)量），室溫放置1min，13,000rpm離心1min，洗脫液即為基因組DNA，冷凍保存。
三、應(yīng)用
用于非小細胞肺癌患者血液循環(huán)DNA含量及完整性的研究：
腫瘤患者血液中的游離DNA(cell free DNA,cfDNA)包括循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)，主要來源于細胞的凋亡和壞死。血液循環(huán)中的癌細胞和遠處轉(zhuǎn)移的癌細胞同樣釋放cfDNA,可以通過檢測cfDNA含量來估算腫瘤負荷、評價治療效果。DNA的完整性(Integrity)有別于非腫瘤人群是腫瘤患者cfDNA的另一個顯著特征。
目前定量常用PCR方法，第一步需要提取血液循環(huán)DNA，這是一個極容易產(chǎn)生誤差的步驟。即便不考慮操作者的因素，提取方法和試劑的不同就會造成巨大誤差。目的研究一種方法，不經(jīng)過DNA提取步驟,直接對血液中的循環(huán)DNA進行定量，可以去除DNA提取試劑盒和操作人員差異造成的DNA提取誤差。方法通過提取和免提取cfDNA直接定量的兩種方法來對比檢測cfDNA，比較兩者的擴增效率,精密度及準確度。
結(jié)果通過特殊的技術(shù)工藝處理，可以直接用血清進行定量PCR，不影響PCR反應(yīng),擴增效率與提純DNA一致，可精確檢測出低至ng水平的血清游離DNA，檢測范圍1-10000ng/ml，本方法具有較高的準確度及精密度。相比先用試劑盒提取cfDNA，在定量結(jié)果的穩(wěn)定性、重復(fù)性等方面都有顯著改善。
非小細胞肺癌患者cfdna含量及完整性的研究背景近年來，血液循環(huán)dna(cfdna)作為一種潛在的腫瘤標志物已經(jīng)受到越來越多人的關(guān)注，因為它的檢測創(chuàng)傷很小而且方便，所以比較容易被人們接受。cfdna的水平在健康人和良性疾病病人中較低，但是在非小細胞肺癌患者的血液中有非常明顯的增加。癌癥病人的循環(huán)腫瘤dna的完整性也是其重要特征之一。因此聯(lián)合cfdna的含量和完整性可能是診斷癌癥的一個很好的指標。
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