血清微小差異將改變實驗結(jié)果
中國微生物菌種查詢網(wǎng) / 2016-10-11 07:01:22
當(dāng)AlastairKhodabukus試著在美國加州大學(xué)戴維斯分校新實驗室制作肌肉纖維時，他發(fā)現(xiàn)一些奇怪的事情：這些組織在痙攣。數(shù)年來，他一直在用同樣的鼠源克隆技術(shù)培養(yǎng)纖維，但這些卻與眾不同。與之前他在英國鄧迪的實驗室培育出的纖維相比，它們需要更多的葡萄糖，而包含的能促進(jìn)更快放松及不易疲勞的蛋白質(zhì)更少。Khodabukus認(rèn)為，這些不同歸因于美國牛的飼養(yǎng)方式不同。
大多數(shù)大學(xué)實驗室采用牛胎兒血清（FBS）培養(yǎng)細(xì)胞。牛的飲食、地理位置、年齡、是否使用激素或抗體，以及牛胎兒孕周等均會產(chǎn)生影響。FBS被作為培養(yǎng)基的補(bǔ)充物，它能影響人造組織的厚度，并能使產(chǎn)物模擬細(xì)胞活動，甚至影響表面接受器對給定化合物的響應(yīng)。
“FBS就像籠罩在頭上的烏云，我們不知道它實際是什么或不是什么?！盞hodabukus說。
而血清只是研究人員在研究細(xì)胞時需要考慮的諸多因素之一。在去年召開的美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）細(xì)胞培養(yǎng)和再生研討會上，生物制藥公司“吉利德科學(xué)”的癌癥生物學(xué)家RichardNeve就擔(dān)憂，研究人員將變得不堪重負(fù)?！昂芏鄬嶒炇颐媾R大量問題?！?br />
一般而言，相關(guān)研究的最基本步驟是確保細(xì)胞的基因一致性。而且，細(xì)胞行為也會受到濃度、增殖率、培養(yǎng)基、污染物和培養(yǎng)時間等的影響。而血清是細(xì)胞培養(yǎng)基中最常見的補(bǔ)充物，并至少應(yīng)保持一致。通常，人類血清包含數(shù)千不同的蛋白質(zhì)和小分子。而FBS復(fù)雜性相似，且富含支持胎兒快速生長的物質(zhì)。
致力于研發(fā)血清替代物的Essential制藥公司的首席科學(xué)館AdamElhofy表示，在血清中，大部分細(xì)胞并不與血液直接接觸，而是被液體包裹著?！把謇镞€富含荷爾蒙、生長因子和其他信號分子?！?br />
走向無血清：為了克服障礙，試劑公司已經(jīng)開發(fā)出無血清培養(yǎng)基?？茖W(xué)家也在追求“生物工藝”的應(yīng)用，例如，藥用蛋白質(zhì)和疫苗的生產(chǎn)。而那些了解細(xì)胞對培養(yǎng)條件微小變化十分敏感的干細(xì)胞研究者也對此十分熱衷。
出于對一致性的擔(dān)憂和推動轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的愿望，越來越多的研究者開始注意如何對待他們的細(xì)胞。MilliporeSigma公司研究部戰(zhàn)略營銷主管KenYoon表示，這些都在鼓勵科學(xué)家遠(yuǎn)離血清。
但無血清培養(yǎng)基并非總是可行的或?qū)嶋H的?！叭绻覀兡懿辉儆肍BS，而是有一些更確定的東西，所有人都同意這是件大事?！泵绹鴩揖C合醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所JonLorsch說，“問題是這有多切合實際？我們不知道答案?！?br />
大部分無血清劑型只針對特定細(xì)胞類型或相關(guān)細(xì)胞系群。例如，供應(yīng)商為中國倉鼠卵巢細(xì)胞提供無血清培養(yǎng)基。但ScienCell實驗室研發(fā)副總監(jiān)JenniferWelser-Alves指出，這些培養(yǎng)基并不適用于所有細(xì)胞類型：許多原始細(xì)胞被移出后，仍需要血清才能生長?！澳隳茏龅脑黾蛹?xì)胞并保持其增長的所有事情都是必要的?！彼f。一些培養(yǎng)基要求增加至少2%的FBS，低劑量的血清有助于減少可變性。
不過，芒特普林森的培養(yǎng)基顧問PaulPrice指出，即便具有可行性，很多研究者也不希望花費(fèi)時間或冒著風(fēng)險，掐斷細(xì)胞的血清供應(yīng)?！白?980年以來，人們一直說血清將成為歷史，但到現(xiàn)在它仍然流行?！?br />
另外，Khodabukus提到，骨骼肌纖維尚沒有商用培養(yǎng)制劑。他花費(fèi)兩年時間修改了配方，結(jié)合了數(shù)十種生長因子和其他信號分子。但當(dāng)纖維的性能隨不同血清出現(xiàn)變化時，打亂了他的研究計劃?！拔矣媱澯媒窈笏袝r間研究這一領(lǐng)域，如果能成功，則將能用于全世界每個實驗室?！?br />
無法擺脫的血清：Khodabukus前博士后導(dǎo)師、加州大學(xué)戴維斯分校的KeithBaar則依靠一種更普通的解決方案：將實驗室溫度降低以儲存血清。當(dāng)血清快要用盡時，他會訂購和檢驗至少4批貨源，觀察它們培養(yǎng)的細(xì)胞的效能，找出與當(dāng)前實驗最匹配的。
之后購買100瓶同樣的血清。雖然這會花費(fèi)其實驗室2.5萬美元，但這也意味著他們能繼續(xù)實驗，不用花數(shù)月時間檢驗更多的血清?？屏_拉多大學(xué)癌癥生物學(xué)家MatthewSikora指出，不檢驗其血清的研究者可能陷入麻煩。
Sikora使用乳腺癌細(xì)胞系研究“弱雌激素”的效應(yīng)。他購買了經(jīng)過木炭處理的血清，以便剝離類膽固醇激素和其他多脂分子。然后他檢驗了血清中的細(xì)胞含有或缺乏雌激素受體，如果血清中的激素能被有效移除，那么這些細(xì)胞的增值效率應(yīng)該一致。
去年，他和同事不得不停止試驗6個月，當(dāng)時連續(xù)批次的血清均無法達(dá)到其實驗?zāi)繕?biāo)。不同的荷爾蒙容量會“完全推翻”對一種癌癥藥物如何工作的解釋。Sikora認(rèn)為，血清中的未知變化能解釋他與合作者不能得到一致結(jié)果的原因。
即便研究人員進(jìn)行批次檢驗，他們也可能不知道應(yīng)當(dāng)注意什么。但奧蘭治兒童醫(yī)院細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)家MariellaSimon表示，研究人員永遠(yuǎn)需要仔細(xì)。理論上，他們應(yīng)該準(zhǔn)備充足的血清完成整個實驗。如果在使用一批新血清時，他們應(yīng)該確保沒有試劑發(fā)生變化，并有足夠的就血清進(jìn)行比對，以避免因血清變化而出現(xiàn)的奇怪結(jié)果。
另外，污染也會擾亂實驗。最陰險的破壞者之一就是支原體。這種微小的細(xì)菌能偷偷溜過消毒器的邊緣，并能抵御多種抗生素。它能吃掉細(xì)胞的營養(yǎng)并能改變DNA及蛋白質(zhì)合成。
傳統(tǒng)的支原體檢驗需要數(shù)周，并仍會遺漏一些稀有菌株。美國模式培養(yǎng)物保藏所標(biāo)準(zhǔn)化工作負(fù)責(zé)人YvonneReid提到，基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的檢驗?zāi)芨焖贉?zhǔn)確地找到答案。
為了避免血清被污染，一些研究人員還選擇使用伽馬射線。包括支原體在內(nèi)的一些普通污染物均對射線十分敏感。但射線也會損害蛋白質(zhì)和生物活性分子的生長。許多供應(yīng)商也提供經(jīng)過伽馬射線照射過的血清，國際血清產(chǎn)業(yè)聯(lián)盟也成立了工作組檢驗這些血清的效果。
錯誤無處不在：細(xì)胞的物理環(huán)境影響深遠(yuǎn)。美國波士頓威斯研究所研究人員發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基僅出現(xiàn)變形和流動就會改變細(xì)胞。不同品牌的實驗室器皿能將不同的化學(xué)物質(zhì)釋放到培養(yǎng)基中，并擾亂細(xì)胞代謝研究。
經(jīng)過認(rèn)真考慮的試劑添加也能以意想不到的方式改變細(xì)胞代謝：抗生素能損害線粒體活性。即便實驗室冰箱的玻璃門也能摧毀研究，原因是培養(yǎng)基中的一些化學(xué)物質(zhì)對光線十分敏感。此外，細(xì)胞在給定的培養(yǎng)皿中的生長也不相同。
在這些實驗中，細(xì)胞本身就變成最大的變數(shù)。英國倫敦大學(xué)學(xué)院癌癥研究員JohnMasters指出，沒有簡單快速的方法能知道細(xì)胞是否符合要求。
美國猶他州細(xì)胞培養(yǎng)顧問LelandFoster則認(rèn)為，“實驗室要遠(yuǎn)離這種變量，需要有專業(yè)人員指導(dǎo)?！彼赋?，培養(yǎng)細(xì)胞最好由細(xì)胞培養(yǎng)專家進(jìn)行，而非實習(xí)生，前者能分辨出細(xì)胞在“微笑還是皺眉頭”。
在快速生長或相對穩(wěn)定階段的細(xì)胞，其反應(yīng)并不相同。如果它們在培養(yǎng)基中的時間過長，還會發(fā)生其他變化，并影響增殖。即便能確證細(xì)胞的遺傳統(tǒng)一性，細(xì)胞的其他重要屬性也無法確證。
Reid提到，由于存在如此多的不確定性，研究人員需要一周或更多時間優(yōu)化細(xì)胞生長，并在實驗開始前總結(jié)生長概況。生長概況能告知研究人員何時收獲細(xì)胞，何時檢測等。
而重要的是，研究人員必須時刻保持警惕。“沒有一套實驗規(guī)程適合所有人?！盢eve說。但忽視細(xì)胞的研究人員將會遇到更多困難?！坝腥说牟┦繉W(xué)位泡湯了、撥款丟了，甚至幾年的工作白干了，原因就是沒有進(jìn)行簡單的質(zhì)量控制?！盡asters說。