凍融對發(fā)酵用大腸桿菌甘油保存的影響！
小楊 / 2020-06-02 08:26:37
1、目的：探討凍融對發(fā)酵用大腸桿菌甘油保存的影響。
2、方法：將大腸桿菌用10%的甘油溶液制成菌懸液，分成3組，測定各組菌種的活菌數(shù)，同時置-20℃冷凍處理。3組分別被凍融處理1、2、3次.測定凍融處理后、凍存1年及2年各組的活菌數(shù)。
3、結(jié)果：隨著凍融次數(shù)的增加,凍融處理后，凍存1年及2年的活菌數(shù)均明顯降低，凍融次數(shù)越多，細(xì)菌存活率越低。
4、結(jié)論：反復(fù)凍融會降低菌種的存活率。
微生物菌種的保存方法因微生物種類不同而有所不同,國內(nèi)外對此有較多的報道.甘油保存法是生產(chǎn)中常用的方法之一.在甘油保存菌種過程中,細(xì)胞內(nèi)外形成的冰晶會對細(xì)胞造成結(jié)構(gòu)上的損傷,從而影響菌種的存活率.本文主要探討了反復(fù)凍融對發(fā)酵用大腸桿菌甘油保存的影響.為制藥和微生物工作者提供具有參考價值的數(shù)據(jù).
一、材料
大腸桿菌PJLA605-HIL2。
LB固體培養(yǎng)基:胰蛋白胨(英國Oxoid)10 g、酵母抽提物(英國 Oxoid)5 g,氯化鈉10 g,溶解并定容至1 000 ml,調(diào)pH至7.2,固體培養(yǎng)基加2%瓊脂。
二、方法和結(jié)果
1、大腸桿菌培養(yǎng)
將待分離的菌種劃LB平板,以取得單菌落,經(jīng)模擬發(fā)酵選出優(yōu)良菌種,將此菌種接到LB斜面上,30℃,培養(yǎng)24 h。
2、大腸桿菌凍存
用10%甘油溶液洗下培養(yǎng)好的菌種,并在無菌小燒杯中混勻,制成濃度為1×108個/ml的菌懸液,然后分裝到eppendorf管中,每支eppendorf管加菌液1 ml,將此菌種分成3組,編號1、2、3,然后放入-20℃冰箱中保存。
3、二次凍存
將2.2項(xiàng)中的第2、3組菌種從-20℃冰箱中取出,于28℃～30℃的水浴鍋中融化,然后再放入-20℃冰箱凍存。
4、三次凍存
將2.3項(xiàng)中的第3組菌種從-20℃冰箱中取出,于28℃～30℃的水浴鍋中融化,然后再放入-20℃冰箱凍存。
5、存活率的測定
采用平板菌落計(jì)數(shù)法.取LB平板9套,每3套為一組,在每組皿底分別標(biāo)明10-7、10-8、10-9,再取9個2 ml西林瓶,依次標(biāo)明10-1、10-2、10-3……10-9,并向西林瓶中各加入無菌水0.9 ml。
用微量取樣器精確吸取第1組菌液0.1 ml注入10-1西林瓶中.將10-1西林瓶內(nèi)的菌液混勻,即成10-1稀釋液.再從10-1西林瓶中取稀釋液0.1 ml注入10-2西林瓶中,重復(fù)上述操作,直至制成10-7、10-8、10-9稀釋液。
分別精確取10-7、10-8、10-9稀釋液0.1 ml注入對應(yīng)的LB平板內(nèi),用玻璃涂布器涂布均勻,于30℃培養(yǎng)24 h后,數(shù)各皿中的菌落數(shù),計(jì)算出同一稀釋度3個平皿上菌落的平均數(shù),根據(jù)菌落數(shù)計(jì)數(shù)活菌數(shù)。
用同樣步驟可計(jì)算出冷凍前3組菌液的活菌數(shù),見表1。
在冷凍后及冷凍后1年、2年分別將3組菌種從-20℃冰箱中取出,于28℃～30℃水浴鍋中融化,用平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù),計(jì)算菌種存活率,如表1。
三、討論
在冷凍保存菌種時加入甘油作保護(hù)劑，雖然可以提高菌種的存活率，但凍融還是會造成菌體結(jié)構(gòu)上的損傷。菌種每凍融一次,其存活率都會明顯下降，經(jīng)處理后的菌種保存1年或2年后,凍融次數(shù)越多，其存活率越低。因此，為使菌種有較高的存活率，不宜反復(fù)凍融。生產(chǎn)用甘油菌種一般保存1年，對1年后的菌種就要對其篩選活化后再用。