一、背景
大鼠原代軟骨細(xì)胞存在于關(guān)節(jié)軟骨中，負(fù)責(zé)分泌II型膠原和其它類(lèi)型的膠原以及非膠原的細(xì)胞外基質(zhì)大分子。成軟骨細(xì)胞的增殖和分化與脊椎動(dòng)物骨架的發(fā)育有著密切的關(guān)系。軟骨細(xì)胞能分泌和響應(yīng)一系列的生長(zhǎng)因子，包括IGF-1和IL1。體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞是研究軟骨修復(fù)和關(guān)節(jié)炎病理的有用模型。
二、胞復(fù)蘇操作要點(diǎn)
1、將基在37℃水浴鍋預(yù)熱；一個(gè)15mL無(wú)菌的離心管，加入8mL預(yù)熱基。
2、將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可一潔凈的燒杯，裝滿(mǎn)37℃的水，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動(dòng)凍存管，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)完全解凍，使細(xì)胞能盡快通過(guò)易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒(méi)入水中，避免引起污染。
3、用75%酒精凍存管后再置于超凈臺(tái)內(nèi)，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至好的離心管內(nèi)，輕輕吹打，使細(xì)胞均勻分散，DMSO濃度，吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。
4、800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的基，吹打制成細(xì)胞懸液。
5、將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)加適量的基，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)。
6、第二天觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況，換新鮮基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過(guò)2~3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
三、細(xì)胞特性
1、組織來(lái)源于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的關(guān)節(jié)組織。
2、細(xì)胞鑒定：Ⅱ型膠原(CollagenⅡ)免疫熒光染色為陽(yáng)性。
3、經(jīng)鑒定細(xì)胞純度高于90%。
4、不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌。
5、細(xì)胞生長(zhǎng)方式：長(zhǎng)梭狀，不規(guī)則細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)。
四、貼壁細(xì)胞傳代
1、提前將基、PBS放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱，用75%酒精后再放入超凈臺(tái)內(nèi)。
2、吸除或倒掉細(xì)胞瓶?jī)?nèi)舊液，加少量PBS潤(rùn)洗細(xì)胞。
3、加入適量胰酶，使胰酶的量能蓋住細(xì)胞，37℃孵育，每隔2~3min顯微鏡下觀察，待貼壁細(xì)胞間間隙變大、細(xì)胞趨于圓形但還未漂起時(shí)棄去胰酶，加入新鮮基，晃動(dòng)細(xì)胞瓶，終止胰酶作用。原代細(xì)胞大鼠軟骨細(xì)胞采購(gòu)商
4、用吸管小心吹打貼壁的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液?？刂拼荡虻牧Χ龋苊猱a(chǎn)生大量的氣泡。
5、將細(xì)胞懸液分別接種到另外的2~3個(gè)細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，加入新鮮基，置37℃溫箱，隔天觀察貼壁生長(zhǎng)情況。
五、應(yīng)用
大鼠原代軟骨細(xì)胞可用于促甲狀腺激素對(duì)小鼠原代軟骨細(xì)胞增殖和分化的影響：
甲狀腺功能減退癥(subclinicalhypothyroidism,SCH),簡(jiǎn)稱(chēng)亞甲減,是臨床上常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝性疾病。亞甲減患者雖然甲狀腺激素水平在正常范圍內(nèi),但是血清中促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)水平升高,偏離正常參考范圍。已有研究證實(shí),高TSH與甲狀腺功能減退的小鼠骨骼發(fā)育異常有關(guān),然而其細(xì)胞機(jī)制仍不清楚。
方法：1、小鼠原代軟骨細(xì)胞(PMCs)的培養(yǎng)及處理:取小鼠膝關(guān)節(jié),去除周?chē)Y(jié)締組織,將軟骨組織與深層軟骨下骨仔細(xì)分離,緩沖液沖洗,剪碎軟骨組織后用0.1%膠原酶消化18.5 h,離心去上清,依次經(jīng)100μm和40μm濾網(wǎng)過(guò)濾。洗滌后用含10%胎牛血清(FBS)、1%雙抗和100μM維生素C的培養(yǎng)液分散培養(yǎng)。隔天換液,待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí),換成含1%FBS的培養(yǎng)基分別以不同處理培養(yǎng)48h,盡可能減少血清中脂蛋白及各種激素對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾作用。
2、用10 mU/ml bTSH處理PMCs特定的時(shí)間,設(shè)置對(duì)照組。用CCK8和EdU試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。
3、用JC-1檢測(cè)細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的改變來(lái)觀察細(xì)胞凋亡情況。應(yīng)用Western blot檢測(cè)促凋亡因子Bax和Bcl-2的表達(dá)水平。
4、用Western blot和免疫熒光染色檢測(cè)自噬相關(guān)標(biāo)志物如LC3、Beclin-1和p62,Western blot mTOR、p-AMPK和AMPK,用透射電鏡檢測(cè)PMCs的自噬情況。
5、采用Alcian blue染色檢測(cè)亞甲減小鼠和正常小鼠軟骨蛋白聚糖的表達(dá)水平。通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)collagen ll和collagen l的表達(dá)情況。
6、通過(guò)RT-PCR檢測(cè)不同整合素亞基的表達(dá)情況。結(jié)果1.CCK-8細(xì)胞增值活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn),細(xì)胞活性在高濃度TSH(10 mU/ml)刺激24h后下降明顯,低濃度組(1 mU/ml)在TSH刺激72h后,細(xì)胞增殖活性也比對(duì)照組產(chǎn)生顯著降低(P<0.05),并持續(xù)下降。
EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果也表明,10mU/mlTSH刺激48h顯著降低PMCs增殖能力(P<0.01),對(duì)照組有增值活性的細(xì)胞百分比為T(mén)SH刺激組的6倍。2.流式結(jié)果顯示,TSH刺激增加線(xiàn)粒體膜電位的去極化,細(xì)胞發(fā)生凋亡。通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證,TSH刺激使促凋亡因子BAX蛋白表達(dá)增加(P<0.01),Bcl-2表達(dá)水平降低(P<0.01),Bcl-2與BAX蛋白表達(dá)水平的比值降低(P<0.05)。3.TSH刺激降低軟骨細(xì)胞自噬水平。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明,LC3 11(P<0.05)和Beclin-1(P<0.01)的表達(dá)水平降低,且在免疫熒光試驗(yàn)的結(jié)果中得到了驗(yàn)證。
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