平板菌落計(jì)數(shù)法的具體操作過程與注意事項(xiàng)及質(zhì)量控制要求！
小楊 / 2026-02-03 10:59:43
百歐博偉生物：平板菌落計(jì)數(shù)法是微生物定量檢測的核心方法，核心原理是單個(gè)活菌在適宜培養(yǎng)基上生長繁殖形成單個(gè)菌落（CFU），通過計(jì)數(shù)平板上菌落數(shù)并結(jié)合稀釋倍數(shù)計(jì)算原始樣品中的活菌濃度，結(jié)果以CFU/mL（液體樣品）或CFU/g（固體樣品）表示，全程需遵循無菌操作、平行試驗(yàn)原則，保證計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。
本流程為國標(biāo)通用版，適用于食品、水質(zhì)、微生物菌液、臨床樣本等常規(guī)菌落計(jì)數(shù)，涵蓋樣品前處理→梯度稀釋→涂布/傾注平板→培養(yǎng)→菌落計(jì)數(shù)→結(jié)果計(jì)算全步驟，同時(shí)包含關(guān)鍵注意事項(xiàng)和質(zhì)量控制要求。
一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、試劑與耗材
培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂（NA，通用細(xì)菌計(jì)數(shù)）、平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA，國標(biāo)首選），按需選擇對應(yīng)選擇性培養(yǎng)基；
稀釋液：無菌生理鹽水（0.85% NaCl）或磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.2~7.4），提前滅菌，每支裝 9mL（用于 10 倍梯度稀釋）或 90mL（用于樣品初稀釋）；
耗材：無菌培養(yǎng)皿（90mm，提前滅菌烘干）、無菌移液管（1mL、10mL，或無菌移液槍頭）、無菌均質(zhì)袋/均質(zhì)杯、酒精燈、L 型玻璃涂布棒（滅菌）、試管架、記號筆、菌落計(jì)數(shù)器（或手動計(jì)數(shù)筆 + 放大鏡）；
其他：天平（精度 0.01g）、恒溫水浴鍋（46℃±1℃，傾注法用）、恒溫培養(yǎng)箱（36℃±1℃，細(xì)菌）/28℃±1℃（霉菌酵母）。
2、無菌操作準(zhǔn)備
超凈工作臺提前 30min 開啟紫外 + 風(fēng)機(jī)滅菌，操作前用 75% 乙醇擦拭臺面；
實(shí)驗(yàn)人員手部消毒，佩戴無菌手套、口罩，操作全程靠近酒精燈火焰區(qū)；
所有無菌耗材開封后僅在火焰區(qū)操作，避免污染。
3、培養(yǎng)基準(zhǔn)備
按培養(yǎng)基說明書稱量，加蒸餾水煮沸溶解，121℃高壓蒸汽滅菌 20min；
傾注法用培養(yǎng)基滅菌后，置于 46℃±1℃恒溫水浴鍋保溫（避免凝固，且溫度不燙傷活菌）；
涂布法可直接將培養(yǎng)基倒平板（每皿 15~20mL），室溫凝固后倒置，4℃保存?zhèn)溆茫ú怀^ 7 天）。
二、樣品前處理
根據(jù)樣品狀態(tài)（液體/固體/半固體）選擇不同處理方式，核心是將樣品均勻分散在稀釋液中，形成菌懸液。
1、液體樣品（如水、菌液、飲料）
澄清無雜質(zhì)液體：充分搖勻樣品（振蕩 10~15s），直接進(jìn)行梯度稀釋；
渾濁/有雜質(zhì)液體：取搖勻后的樣品，通過無菌雙層紗布過濾（去除大顆粒雜質(zhì)，避免干擾計(jì)數(shù)），取濾液稀釋。
2、固體/半固體樣品（如食品、土壤、糞便）
核心：均質(zhì)化，保證菌體充分釋放
準(zhǔn)確稱取25g 樣品（精度 0.01g），放入盛有225mL 無菌稀釋液的無菌均質(zhì)袋中；
將均質(zhì)袋放入拍擊式均質(zhì)器，設(shè)置8000~10000r/min，均質(zhì) 1~2min（無均質(zhì)器時(shí)，可用無菌玻璃棒充分研磨，或手搖 30min，保證樣品分散）；
均質(zhì)后靜置 1min（讓大顆粒沉淀），上層液體即為1:10（10?¹）的菌懸液。
三、系列梯度稀釋（10 倍稀釋法）
核心原則：稀釋至平板菌落數(shù)在 30~300 之間（此范圍為計(jì)數(shù)有效區(qū)間，<30 則誤差大，>300 則菌落重疊、難以區(qū)分），常規(guī)稀釋至 10?³~10??，根據(jù)樣品污染程度調(diào)整（如純菌液需稀釋至 10??~10??，清潔水質(zhì)稀釋至 10?¹~10?³）。操作全程無菌，移液管/槍頭一管一換，避免交叉污染取 1 支裝有 9mL 無菌稀釋液的試管，標(biāo)記為10?²；
用無菌 1mL 移液管/移液槍，吸取1mL 10?¹ 菌懸液，沿試管壁緩慢注入 9mL 稀釋液中（避免產(chǎn)生氣泡）；
用移液管吹吸 3 次（或輕搖試管 10~15s），充分混勻，即為10?² 菌懸液；
按上述方法，依次稀釋得到10?³、10??、10??…… 系列梯度菌懸液，每稀釋一次更換新的移液管/槍頭；
稀釋完成后，靜置 1min，待菌體均勻分布后再進(jìn)行平板接種。
四、平板接種（兩種方法：傾注法/涂布法，按需選擇）
接種時(shí)需做平行試驗(yàn)：每個(gè)稀釋度至少做2 個(gè)平行平板，同時(shí)設(shè)置空白對照（僅加稀釋液 + 培養(yǎng)基，無樣品，驗(yàn)證無菌操作和培養(yǎng)基是否污染）。
方法 1：傾注法（國標(biāo)首選，適用于細(xì)菌計(jì)數(shù)，菌落生長均勻）
用無菌移液管/移液槍，吸取1mL 某一稀釋度的菌懸液，緩慢注入無菌培養(yǎng)皿中央（避免菌液粘壁）；
立即向培養(yǎng)皿中倒入15~20mL 46℃±1℃的熔化培養(yǎng)基，快速將培養(yǎng)皿在桌面上輕輕旋轉(zhuǎn)搖勻（順時(shí)針 + 逆時(shí)針），使菌液與培養(yǎng)基充分混合，避免菌落成團(tuán)；
靜置待培養(yǎng)基完全凝固（室溫 15~20min），倒置培養(yǎng)皿（防止培養(yǎng)過程中冷凝水滴落，沖散菌落或造成污染）。
方法 2：涂布法（適用于霉菌、酵母，或需觀察菌落形態(tài)的計(jì)數(shù)，菌落生長在平板表面，便于計(jì)數(shù)和挑?。?/strong>
取提前制備好的固體平板，用無菌移液管/移液槍吸取0.1mL 某一稀釋度的菌懸液，滴加在平板中央；
將 L 型玻璃涂布棒在酒精燈火焰上滅菌，冷卻后（輕觸平板培養(yǎng)基表面，無燙痕即可），將菌液均勻涂布在整個(gè)平板表面（從中央向四周緩慢涂布，避免菌液溢出）；
涂布后靜置 5~10min，讓菌液完全被培養(yǎng)基吸收，倒置培養(yǎng)皿。
關(guān)鍵要點(diǎn)
稀釋度選擇：至少選擇2~3 個(gè)連續(xù)稀釋度接種（保證有一個(gè)稀釋度的菌落數(shù)落在 30~300 之間）；
空白對照：同法加入 1mL 稀釋液（傾注法）或 0.1mL 稀釋液（涂布法），與樣品平板同時(shí)培養(yǎng)，空白對照平板菌落數(shù)應(yīng)≤0，否則實(shí)驗(yàn)無效。
五、恒溫培養(yǎng)
根據(jù)微生物類型設(shè)置培養(yǎng)溫度和時(shí)間，培養(yǎng)期間不隨意打開培養(yǎng)箱，避免溫度波動：
細(xì)菌（總菌落數(shù)）：36℃±1℃，培養(yǎng)48h±2h；
霉菌、酵母：28℃±1℃，培養(yǎng)72h~5d（霉菌酵母生長慢，需培養(yǎng)至菌落形態(tài)清晰、無新菌落長出）；
選擇性培養(yǎng)基計(jì)數(shù)（如大腸菌群、金黃色葡萄球菌）：按對應(yīng)培養(yǎng)基說明書設(shè)置培養(yǎng)條件（如
大腸菌群 36℃培養(yǎng) 24h）。
六、菌落計(jì)數(shù)（核心步驟，嚴(yán)格遵循計(jì)數(shù)規(guī)則）
培養(yǎng)結(jié)束后，取出平板，先觀察空白對照（無污染再進(jìn)行樣品計(jì)數(shù)），用菌落計(jì)數(shù)器或在自然光下（配合放大鏡）手動計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)時(shí)做好記錄（稀釋度、平行平板的菌落數(shù)）。
1、通用計(jì)數(shù)規(guī)則
有效平板：僅計(jì)數(shù)菌落數(shù) 30~300 之間的平板，此范圍外的平板不計(jì)入結(jié)果（<30 記為“<30”，>300 記為“>300”）；
菌落合并：相距較近的菌落（距離 < 1mm），若能區(qū)分單個(gè)菌落形態(tài)，計(jì)為多個(gè)；若完全融合成菌苔，該平板作廢；
微小菌落：培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間，肉眼可見的菌落均計(jì)為有效，避免漏計(jì)微小菌落；
雜菌菌落：若為總菌落數(shù)計(jì)數(shù)，所有肉眼可見菌落均計(jì)入；若為選擇性計(jì)數(shù)，僅計(jì)數(shù)符合目標(biāo)菌形態(tài)的菌落（如
金黃色葡萄球菌在 BP 平板上為黑色菌落，周圍有暈圈）。
2、特殊情況計(jì)數(shù)
平板邊緣菌落：培養(yǎng)皿邊緣的菌落，若為均勻生長的單個(gè)菌落，正常計(jì)數(shù)（避免因“邊緣效應(yīng)”漏計(jì)）；
氣泡周圍菌落：培養(yǎng)基內(nèi)氣泡周圍的菌落，若為單個(gè)活菌形成，正常計(jì)數(shù)；
多稀釋度有效：若有 2~3 個(gè)稀釋度的平板菌落數(shù)均在 30~300 之間，選擇菌落數(shù)最接近中間值的稀釋度，或取多個(gè)稀釋度的平均值（按國標(biāo)公式計(jì)算）。
3、平行平板處理
同一稀釋度的 2 個(gè)平行平板，菌落數(shù)差值不得超過平均值的 10%（如平均值 100，兩平板菌落數(shù)應(yīng)在 90~110 之間），若差值過大，該稀釋度結(jié)果作廢，重新實(shí)驗(yàn)。
七、結(jié)果計(jì)算
根據(jù)樣品類型（液體/固體）和接種方法（傾注法 1mL/涂布法 0.1mL），選擇對應(yīng)公式計(jì)算，結(jié)果保留2 位有效數(shù)字（或按國標(biāo)要求修約）。
公式 1：液體樣品（傾注法，接種量 1mL）
樣品活菌濃度（CFU/mL）= 平板平均菌落數(shù) × 稀釋倍數(shù)例：10??稀釋度的 2 個(gè)平行平板菌落數(shù)為 86 和 94，平均值 =(86+94)/2=90，濃度 = 90×10?=9.0×10? CFU/mL。
公式 2：固體樣品（初稀釋為 25g→225mL，即 10?¹，傾注法 1mL）
樣品活菌濃度（CFU/g）= 平板平均菌落數(shù) × 稀釋倍數(shù) × 10（×10 是因?yàn)?25g 樣品稀釋至 225mL，相當(dāng)于 1g 樣品對應(yīng) 10mL 菌懸液，即初稀釋倍數(shù)為 10）例：25g 食品樣品，10?³ 稀釋度平板平均菌落數(shù)為 120，濃度 = 120×10³×10=1.2×10? CFU/g。
公式 3：涂布法（接種量 0.1mL，液體/固體樣品通用）
需在上述公式基礎(chǔ)上 **×10**（因接種量為 0.1mL，相當(dāng)于 1mL 菌懸液的菌落數(shù)為平板計(jì)數(shù) ×10）：
液體：CFU/mL = 平均菌落數(shù) × 稀釋倍數(shù) × 10
固體：CFU/g = 平均菌落數(shù) × 稀釋倍數(shù) × 10 × 10
八、實(shí)驗(yàn)收尾與記錄
計(jì)數(shù)完成后，將所有培養(yǎng)皿進(jìn)行高壓蒸汽滅菌（121℃，20min） 后再丟棄，避免微生物污染環(huán)境；
完整記錄實(shí)驗(yàn)信息：樣品名稱、取樣量、稀釋倍數(shù)、接種方法、培養(yǎng)條件、平行平板菌落數(shù)、空白對照結(jié)果、最終活菌濃度；
整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，填寫菌落計(jì)數(shù)報(bào)告。
九、關(guān)鍵注意事項(xiàng)與質(zhì)量控制（保證結(jié)果準(zhǔn)確的核心）
無菌操作貫穿全程：超凈臺滅菌、耗材滅菌、手部消毒，避免雜菌污染，空白對照必須無菌；
樣品充分搖勻/均質(zhì)：固體樣品均質(zhì)不充分會導(dǎo)致菌體釋放不完全，結(jié)果偏低；液體樣品未搖勻會導(dǎo)致菌體分布不均，平行平板誤差大；
稀釋液溫度與量：傾注法培養(yǎng)基溫度嚴(yán)格控制在 46℃±1℃，溫度過高會殺死活菌，過低會提前凝固；每皿培養(yǎng)基量 15~20mL，過薄易干裂，過厚菌落生長慢；
移液準(zhǔn)確：移液管/槍頭需校準(zhǔn)，吸取菌液時(shí)平視刻度，避免吸量過多或過少；
平行試驗(yàn)與重復(fù)：每個(gè)稀釋度至少 2 個(gè)平行平板，若實(shí)驗(yàn)要求高，可做 3 個(gè)平行，減少偶然誤差；
菌落形態(tài)區(qū)分：選擇性計(jì)數(shù)時(shí)，嚴(yán)格按目標(biāo)菌的菌落形態(tài)計(jì)數(shù)（如
大腸菌群在 EMB 平板上為紫黑色帶金屬光澤菌落），避免將雜菌計(jì)入；
培養(yǎng)時(shí)間準(zhǔn)確：培養(yǎng)不足會導(dǎo)致菌落未長出，計(jì)數(shù)偏低；培養(yǎng)過長會導(dǎo)致菌落融合，難以區(qū)分。
十、方法適用范圍與替代方法
平板菌落計(jì)數(shù)法：適用于可培養(yǎng)的活菌計(jì)數(shù)，結(jié)果準(zhǔn)確，為國標(biāo)法定方法，但耗時(shí)較長（細(xì)菌 48h，霉菌 5d），無法計(jì)數(shù)不可培養(yǎng)的微生物；
替代快速計(jì)數(shù)法：若需快速得到結(jié)果，可使用菌落計(jì)數(shù)器自動計(jì)數(shù)、比濁法（OD 值換算）、流式細(xì)胞術(shù)等，其中比濁法為間接計(jì)數(shù)法，結(jié)果為總菌數(shù)（含活菌和死菌），需與平板法校準(zhǔn)后使用。
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