微生物實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)致病性真菌的培養(yǎng)鑒定流程及注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-12-17 10:34:53
百歐博偉生物：常見(jiàn)致病性真菌的培養(yǎng)鑒定流程是一個(gè)從樣本處理到菌種確認(rèn)的系統(tǒng)化操作，核心圍繞分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)展開(kāi)，同時(shí)結(jié)合分子生物學(xué)方法提升準(zhǔn)確性，具體流程如下：
一、樣本采集與預(yù)處理
1、樣本類(lèi)型
致病性真菌的臨床樣本包括皮膚鱗屑、甲屑、毛發(fā)、痰液、血液、腦脊液、尿液、生殖道分泌物等；環(huán)境樣本則包括食品、土壤、空氣采樣拭子等。
2、預(yù)處理原則
無(wú)菌操作：所有步驟需在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，避免雜菌污染。
樣本處理：
皮膚/甲屑/毛發(fā)：用 75% 乙醇消毒表面 1–2 min，無(wú)菌生理鹽水沖洗后研磨，制成懸液。
體液樣本（血液、腦脊液）：需先進(jìn)行增菌培養(yǎng)（如用腦心浸液培養(yǎng)基），再轉(zhuǎn)種至真菌培養(yǎng)基；痰液需接種前挑取膿性部分，去除黏液。
環(huán)境樣本：固體樣本（土壤）需梯度稀釋?zhuān)后w樣本直接涂布。
二、分離培養(yǎng)（核心步驟）
1、培養(yǎng)基選擇
初次分離：優(yōu)先使用沙堡葡萄糖瓊脂（SDA），添加氯霉素（抑制細(xì)菌）、放線菌酮（抑制腐生真菌），用于選擇性分離致病性真菌。
特殊需求：
念珠菌快速鑒定：使用科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，不同菌種會(huì)形成特征性顏色菌落。
雙相性真菌（如組織胞漿菌）：需同時(shí)接種 25℃（絲狀相）和 37℃（酵母相）的 SDA 平板。
2、接種與培養(yǎng)條件
接種方法：涂布法（液體樣本）、劃線法（固體樣本），每個(gè)樣本接種 2 個(gè)平板（避免污染）。
培養(yǎng)條件：
絲狀真菌（皮膚癬菌、曲霉）：25–28℃ 需氧培養(yǎng)，濕度保持 60%–80%，培養(yǎng) 3–7 天。
致病性酵母菌（念珠菌、隱球菌）：35–37℃ 需氧培養(yǎng)，培養(yǎng) 24–48 小時(shí)。
雙相性真菌：分別在 25℃ 和 37℃ 培養(yǎng)，觀察形態(tài)轉(zhuǎn)換。
三、初步鑒定（形態(tài)學(xué)觀察）
通過(guò)菌落形態(tài)和顯微鏡下結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步判斷，分為酵母菌和絲狀真菌兩類(lèi)：
1、酵母菌的初步鑒定
菌落觀察：觀察 SDA 上菌落的大小、顏色、質(zhì)地（如
白念珠菌為乳白色奶油狀，
新生隱球菌為黏液狀）。
顯微鏡觀察：取菌落邊緣少量菌體，經(jīng)革蘭染色或墨汁負(fù)染后鏡檢：
白念珠菌：革蘭陽(yáng)性卵圓形芽生孢子，可見(jiàn)假菌絲；
新生隱球菌：墨汁負(fù)染后可見(jiàn)寬厚莢膜，無(wú)假菌絲。
快速試驗(yàn)：白念珠菌可做芽管形成試驗(yàn)（接種于人血清，37℃ 培養(yǎng) 2–4 小時(shí)，鏡檢見(jiàn)芽管）。
2、絲狀真菌的初步鑒定
菌落觀察：記錄菌落形態(tài)（絮狀、絨毛狀、粉末狀）、顏色（氣生菌絲顏色、背面顏色）、生長(zhǎng)速度（如毛霉生長(zhǎng)迅速，3 天可鋪滿平板）。
顯微鏡觀察：采用透明膠帶法或乳酸酚棉藍(lán)染色法，觀察菌絲、孢子的形態(tài)和排列方式：
曲霉：有隔菌絲，分生孢子頭呈“掃帚狀”或“放射狀”；
皮膚癬菌：有隔菌絲，產(chǎn)生大分生孢子（如紅色毛癬菌的大分生孢子呈棒狀）；
毛霉：無(wú)隔菌絲，孢子囊呈球形，內(nèi)含孢子囊孢子。
四、確認(rèn)鑒定（生理生化 + 分子生物學(xué)試驗(yàn)）
初步鑒定后需進(jìn)一步試驗(yàn)確認(rèn)菌種，保證準(zhǔn)確性：
1、生理生化試驗(yàn)（針對(duì)酵母菌）
糖發(fā)酵試驗(yàn)：檢測(cè)酵母菌對(duì)葡萄糖、麥芽糖、蔗糖等的發(fā)酵能力（產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況），如
白念珠菌發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖，不發(fā)酵乳糖。
碳源同化試驗(yàn)：使用 API 20C AUX 試劑盒，通過(guò)酵母菌對(duì)不同碳源的利用情況，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)鑒定菌種。
尿素酶試驗(yàn)：
新生隱球菌尿素酶陽(yáng)性，念珠菌陰性，可快速區(qū)分。
2、分子生物學(xué)鑒定（金標(biāo)準(zhǔn)，適用于疑難菌種）
PCR 測(cè)序：擴(kuò)增真菌保守基因，測(cè)序后與 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，準(zhǔn)確率 > 95%。
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR：針對(duì)特定致病菌（如
曲霉、
隱球菌）的特異性基因設(shè)計(jì)引物，可實(shí)現(xiàn)快速定量檢測(cè)。
基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜：通過(guò)檢測(cè)菌體蛋白指紋圖譜，與數(shù)據(jù)庫(kù)匹配鑒定菌種，操作快速（10–20 min）。
五、報(bào)告與結(jié)果判定
綜合培養(yǎng)條件、菌落形態(tài)、鏡檢結(jié)構(gòu)、生理生化/分子生物學(xué)結(jié)果，判定致病菌種類(lèi)。
臨床樣本需區(qū)分污染菌和致病菌：如痰液中分離出曲霉，需結(jié)合患者臨床癥狀判斷是否致??；血液中分離出念珠菌則直接提示念珠菌血癥。
六、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
雙相性真菌需嚴(yán)格控制溫度，25℃ 培養(yǎng)為絲狀相，37℃ 培養(yǎng)為酵母相，形態(tài)轉(zhuǎn)換是重要鑒定依據(jù)。
致病性真菌（如組織胞漿菌、球孢子菌）屬于生物安全三級(jí)（BSL-3）菌，操作需在相應(yīng)生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。
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