厭氧培養(yǎng)方法：原理、操作流程、關(guān)鍵技術(shù)與質(zhì)量控制！
小楊 / 2025-11-18 10:31:58
百歐博偉生物：厭氧微生物的生長依賴無氧環(huán)境，其培養(yǎng)核心是徹底清除培養(yǎng)體系中的氧氣，并維持適宜的溫度、pH、營養(yǎng)條件。以下是結(jié)構(gòu)化的厭氧培養(yǎng)技術(shù)體系，涵蓋原理、常用方法、操作細(xì)節(jié)、優(yōu)化策略及質(zhì)量控制，適用于科研、臨床檢測及工業(yè)生產(chǎn)場景。
一、厭氧培養(yǎng)的核心原理
1、氧氣對厭氧菌的毒性機(jī)制：
厭氧菌缺乏超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶，無法清除代謝過程中產(chǎn)生的超氧陰離子（O??）、過氧化氫（H?O?）等活性氧（ROS），導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷（如細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、DNA 斷裂）。
部分嚴(yán)格厭氧菌的能量代謝酶對氧氣高度敏感，氧氣會直接抑制酶活性，阻斷能量產(chǎn)生。
2、厭氧培養(yǎng)的關(guān)鍵目標(biāo)：
降低環(huán)境中氧氣濃度（嚴(yán)格厭氧菌需 O?＜0.5%，兼性厭氧菌可耐受低氧）；
維持還原型環(huán)境（常用氧化還原電位 Eh 表示，厭氧菌適宜 Eh 為 - 150~-400 mV）；
提供專屬營養(yǎng)（如維生素 B 族、生長因子、復(fù)雜有機(jī)物）。
二、常用厭氧培養(yǎng)方法（按場景分類）
（一）實驗室小規(guī)模培養(yǎng)（適用于菌株分離、純培養(yǎng)、功能驗證）
1、厭氧罐培養(yǎng)法（最常用，操作簡便、成本低）
原理：利用密封罐內(nèi)的化學(xué)產(chǎn)氣劑消耗氧氣，同時產(chǎn)生 CO?（部分厭氧菌需 CO?刺激生長），構(gòu)建無氧環(huán)境。
核心組件：
密封厭氧罐（玻璃或不銹鋼材質(zhì)，帶密封墊圈和壓力表）；
化學(xué)產(chǎn)氣包（常用“產(chǎn)氣劑 + 催化劑”組合，如硼氫化鈉 - 檸檬酸體系）；
厭氧指示劑（亞甲基藍(lán)：有氧時藍(lán)色，無氧時無色；刃天青：有氧時粉紅色，無氧時無色）。
操作步驟：
預(yù)處理：將培養(yǎng)基（固體平板/液體試管）高壓滅菌后，置于 37℃培養(yǎng)箱預(yù)熱（避免罐內(nèi)溫度驟降導(dǎo)致冷凝水產(chǎn)生）；
接種：在超凈工作臺中快速接種樣品（如菌落、菌液），液體培養(yǎng)基需裝滿試管（減少頂空氧氣），固體平板倒置放入罐內(nèi)；
放置產(chǎn)氣包與指示劑：將產(chǎn)氣包和指示劑紙條放在罐內(nèi)角落，確保指示劑不接觸培養(yǎng)基；
密封與產(chǎn)氣：擰緊罐蓋，確保密封良好，產(chǎn)氣包遇水（培養(yǎng)基中的水分或少量添加水）后開始反應(yīng)，消耗 O?并產(chǎn)生 CO?（反應(yīng)式：NaBH? + 2H?O → NaBO? + 4H?↑，2H? + O? → 2H?O，同時釋放 CO?）；
培養(yǎng)：將厭氧罐放入恒溫培養(yǎng)箱（根據(jù)菌株最適溫度，如 37℃ for 腸道厭氧菌，28℃ for 環(huán)境厭氧菌），培養(yǎng)時間 24~72 h（嚴(yán)格厭氧菌可能需 5~7 天）。
注意事項：
產(chǎn)氣包需在使用前開封，避免提前吸潮失效；
罐內(nèi)不可放置過多培養(yǎng)基（不超過罐容積的 1/2），確保氣體流通；
培養(yǎng)結(jié)束后，打開罐蓋時需緩慢放氣，避免空氣驟入導(dǎo)致厭氧菌死亡。
2、滾管技術(shù)（適用于嚴(yán)格厭氧菌的分離與純培養(yǎng)）
原理：通過“無氧操作 + 瓊脂滾管”實現(xiàn)厭氧菌的單菌落分離，全程避免氧氣接觸。
核心設(shè)備：厭氧操作管、無氧氣體鋼瓶（N?/CO?/H?混合氣體，比例通常為 85:10:5）、滾管機(jī)、厭氧手套箱（可選）。
操作步驟：
培養(yǎng)基制備：配置適宜的厭氧培養(yǎng)基（如強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基 RCM），加入瓊脂（1.5%~2%），高壓滅菌后，在無氧氣體氛圍下冷卻至 50~55℃（避免瓊脂凝固）；
無氧接種：將待分離樣品在無氧操作管中接種到融化的培養(yǎng)基中，快速搖勻；
滾管：將接種后的試管水平放置在滾管機(jī)上，緩慢滾動，使培養(yǎng)基均勻附著在試管內(nèi)壁，形成薄層瓊脂；
培養(yǎng)：將滾管直立放入?yún)捬豕藁蚴痔紫渲校銣嘏囵B(yǎng)，待單菌落形成后挑取純化。
優(yōu)勢：可分離嚴(yán)格厭氧菌，避免接種過程中氧氣污染；
關(guān)鍵要點(diǎn)：培養(yǎng)基冷卻過程中需持續(xù)通入無氧氣體，防止氧氣溶解。
3、厭氧手套箱培養(yǎng)法（適用于高精度、長時間培養(yǎng)）
原理：手套箱內(nèi)維持無氧、恒溫、恒濕環(huán)境，操作人員通過手套進(jìn)行全程無菌操作，避免氧氣接觸。
核心配置：
厭氧手套箱（含氣體凈化系統(tǒng)、恒溫控制系統(tǒng)、手套操作口）；
無氧氣體（N?/CO?/H?混合氣體）；
催化劑（鈀催化劑，用于分解 H?與 O?反應(yīng)生成的水）。
操作步驟：
手套箱預(yù)處理：開啟氣體凈化系統(tǒng)，置換箱內(nèi)空氣（通入混合氣體，排出 O?），直至箱內(nèi) O?濃度＜0.1%（通過內(nèi)置氧傳感器監(jiān)測），同時啟動恒溫（如 37℃）；
樣品與培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入：將接種好的培養(yǎng)基、菌種、實驗器材通過傳遞艙放入箱內(nèi)（傳遞艙需先抽真空再通入無氧氣體，反復(fù) 2~3 次，徹底清除氧氣）；
培養(yǎng)操作：在手套箱內(nèi)進(jìn)行菌落挑取、接種、傳代等操作，培養(yǎng)皿或試管直接置于箱內(nèi)培養(yǎng)架上；
后續(xù)處理：培養(yǎng)結(jié)束后，通過傳遞艙取出樣品，避免箱內(nèi)環(huán)境被污染。
優(yōu)勢：操作便捷，可進(jìn)行復(fù)雜實驗（如細(xì)胞計數(shù)、功能檢測），適合對氧氣極度敏感的厭氧菌；
注意事項：定期更換催化劑和氣體凈化柱，監(jiān)測箱內(nèi) O?濃度和濕度（避免培養(yǎng)基干燥）。
（二）工業(yè)大規(guī)模培養(yǎng)（適用于發(fā)酵生產(chǎn)、菌種擴(kuò)繁）
1、厭氧發(fā)酵罐培養(yǎng)法
原理：利用密封發(fā)酵罐，通過無氧氣體置換、攪拌、密封設(shè)計，維持大規(guī)模培養(yǎng)體系的無氧環(huán)境，同時控制溫度、pH、溶氧（DO）、營養(yǎng)供給等參數(shù)。
核心設(shè)備：厭氧發(fā)酵罐（帶密封攪拌槳、氣體進(jìn)出口、pH/DO 傳感器、溫度控制系統(tǒng)）、無氧氣體鋼瓶、蒸汽滅菌系統(tǒng)。
操作流程：
發(fā)酵罐滅菌：將培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐，通入蒸汽滅菌（121℃，30 min），冷卻至發(fā)酵溫度；
無氧置換：向發(fā)酵罐內(nèi)通入無氧氣體（N?或 CO?），置換頂空和培養(yǎng)基中的氧氣，直至 DO＜0.1%；
接種：在無菌條件下，將種子液接入發(fā)酵罐（接種量通常為 5%~10%）；
發(fā)酵控制：維持溫度（如 37℃）、pH（通過添加酸 / 堿調(diào)節(jié)，如厭氧菌適宜 pH 6.0~7.5），攪拌速率適中（避免過度攪拌導(dǎo)致氧氣溶解），定期補(bǔ)加營養(yǎng)物質(zhì)（如葡萄糖、氨基酸）；
收獲：發(fā)酵結(jié)束后，在無氧條件下收獲菌液或代謝產(chǎn)物。
關(guān)鍵技術(shù)：
密封設(shè)計：發(fā)酵罐軸封采用機(jī)械密封或磁力攪拌，避免空氣泄漏；
溶氧監(jiān)測：使用在線 DO 傳感器實時監(jiān)測，及時補(bǔ)充無氧氣體；
防污染：全程無菌操作，發(fā)酵罐滅菌徹底，避免雜菌（如兼性厭氧菌）污染。
2、靜態(tài)厭氧培養(yǎng)法（適用于低需求、大規(guī)模擴(kuò)繁）
原理：利用大容量密封容器（如厭氧袋、密封桶），通過化學(xué)產(chǎn)氣劑或無氧氣體置換，構(gòu)建無氧環(huán)境，適用于液體培養(yǎng)基的大規(guī)模培養(yǎng)。
操作要點(diǎn)：
容器選擇：使用食品級塑料密封桶或厭氧袋，確保密封性能良好；
培養(yǎng)基制備：配置液體培養(yǎng)基，高壓滅菌后冷卻至室溫；
無氧處理：向容器內(nèi)加入產(chǎn)氣包或通入無氧氣體，密封后放入恒溫培養(yǎng)箱；
攪拌：定期手動搖勻（避免氧氣進(jìn)入），或使用磁力攪拌器（密封設(shè)計）。
優(yōu)勢：成本低、操作簡單，適用于工業(yè)生產(chǎn)中菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)（如益生菌發(fā)酵）。
三、厭氧培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)要素（提高成功率）
1、培養(yǎng)基優(yōu)化
營養(yǎng)需求：厭氧菌多為異養(yǎng)型，需提供復(fù)雜有機(jī)物、生長因子、還原物質(zhì)；
特殊添加物：
嚴(yán)格厭氧菌需添加甲烷前體；
腸道厭氧菌需添加膽汁鹽（模擬腸道環(huán)境）；
pH 調(diào)節(jié)：根據(jù)菌株特性調(diào)節(jié) pH（如雙歧桿菌適宜 pH 6.5~7.0，梭菌適宜 pH 6.0~7.5），避免培養(yǎng)基酸化或堿化；
滅菌處理：培養(yǎng)基需高壓蒸汽滅菌（121℃，15~30 min），避免滅菌不徹底導(dǎo)致雜菌污染。
2、無氧環(huán)境驗證與維持
指示劑使用：每次培養(yǎng)需放置厭氧指示劑，確保無氧環(huán)境構(gòu)建成功；
氣體純度：無氧氣體純度需≥99.99%，避免混入氧氣；
避免氧氣溶解：液體培養(yǎng)基滅菌后冷卻時，需通入無氧氣體，驅(qū)除溶解在培養(yǎng)基中的氧氣；
操作速度：接種、轉(zhuǎn)接等操作需快速，減少樣品暴露在空氣中的時間（嚴(yán)格厭氧菌暴露時間≤5 min）。
3、無菌操作與污染控制
環(huán)境消毒：超凈工作臺、厭氧手套箱、發(fā)酵罐需定期消毒（如 75% 乙醇擦拭、紫外線照射 30 min）；
器具滅菌：接種環(huán)、試管、培養(yǎng)皿等需高壓滅菌或干熱滅菌（160℃，2 h）；
雜菌檢測：培養(yǎng)過程中定期觀察培養(yǎng)基是否渾濁、出現(xiàn)異常菌落，若發(fā)現(xiàn)污染，立即終止培養(yǎng)并排查原因（如滅菌不徹底、操作污染）；
避免兼性厭氧菌污染：兼性厭氧菌（如
大腸桿菌）在無氧環(huán)境中也能生長，會與厭氧菌競爭營養(yǎng)，需通過選擇性培養(yǎng)基（如添加抗生素、特殊底物）抑制雜菌。
4、溫度與培養(yǎng)時間控制
溫度選擇：根據(jù)菌株最適生長溫度培養(yǎng)（如人體厭氧菌 37℃，土壤厭氧菌 25~30℃，嗜熱厭氧菌 55~65℃）；
培養(yǎng)時間：嚴(yán)格厭氧菌生長緩慢，需延長培養(yǎng)時間（如產(chǎn)甲烷菌需 5~7 天，雙歧桿菌需 24~48 h），避免過早終止培養(yǎng)導(dǎo)致菌株未生長。
四、常見問題與解決方案
問題類型 可能原因 解決方案
厭氧菌不生長 1.無氧環(huán)境未構(gòu)建成功；2.培養(yǎng)基營養(yǎng)不足；3.溫度/pH 不適宜；4.菌株活力低 1.更換產(chǎn)氣包/檢查手套箱氣體凈化系統(tǒng)，確保 O?＜0.5%；2.優(yōu)化培養(yǎng)基；3.調(diào)整溫度/pH 至菌株最適范圍；4.復(fù)蘇菌株時延長活化時間
培養(yǎng)基出現(xiàn)雜菌污染 1.滅菌不徹底；2.操作過程中空氣進(jìn)入；3.樣品本身含雜菌 1.檢查滅菌設(shè)備，延長滅菌時間；2.接種時快速操作，避免培養(yǎng)基暴露在空氣中；3.使用選擇性培養(yǎng)基
菌落形態(tài)異常 1.氧氣殘留（抑制生長）；2.營養(yǎng)不足；3.攪拌過度（液體培養(yǎng)） 1.增加無氧氣體置換次數(shù)，添加還原物質(zhì)；2.補(bǔ)加蛋白胨、葡萄糖等營養(yǎng)；3.降低攪拌速率，避免氧氣溶解
厭氧指示劑不變色 1.產(chǎn)氣包失效；2.密封不嚴(yán)；3.指示劑過期 1.使用新產(chǎn)氣包，確保開封后立即使用；2.檢查厭氧罐/手套箱密封性能，更換密封墊圈；3.更換有效期內(nèi)的指示劑
五、質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程
1、環(huán)境質(zhì)量控制
定期監(jiān)測厭氧罐/手套箱內(nèi) O?濃度（使用氧傳感器或指示劑），確保 O?＜0.5%（嚴(yán)格厭氧菌＜0.1%）；
實驗臺面、設(shè)備定期消毒（75% 乙醇、含氯消毒劑），避免交叉污染。
2、培養(yǎng)基質(zhì)量控制
每批次培養(yǎng)基需進(jìn)行無菌檢驗（空白培養(yǎng)，確認(rèn)無雜菌生長）；
3、菌株質(zhì)量控制
接種前需復(fù)蘇菌株（在適宜培養(yǎng)基中活化 1~2 代），確保菌株活力；
培養(yǎng)結(jié)束后，通過形態(tài)學(xué)觀察（菌落形態(tài)、革蘭氏染色）、生化鑒定（如代謝產(chǎn)物檢測）確認(rèn)目標(biāo)菌株。
4、操作標(biāo)準(zhǔn)化
制定 SOP（標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程），明確厭氧培養(yǎng)的操作步驟、參數(shù)設(shè)置、安全注意事項；
操作人員需經(jīng)過培訓(xùn)，熟練掌握無氧操作技巧，避免人為失誤導(dǎo)致實驗失敗。
六、應(yīng)用領(lǐng)域與前景
科研領(lǐng)域：厭氧菌分離鑒定、功能基因研究（如產(chǎn)氫、產(chǎn)短鏈脂肪酸機(jī)制）、微生物組學(xué)研究（如腸道厭氧菌與疾病關(guān)聯(lián)）；
臨床檢測：糞便、膿液中厭氧菌（如
艱難梭菌、
脆弱擬桿菌）的分離培養(yǎng)，輔助感染性疾病診斷；
工業(yè)生產(chǎn)：益生菌（
雙歧桿菌、
乳酸菌）發(fā)酵、生物燃料（如甲烷、氫氣）生產(chǎn)、抗生素合成；
環(huán)境治理：厭氧菌降解有機(jī)污染物（如石油、農(nóng)藥）、污水處理（厭氧消化工藝）。
隨著微生物組學(xué)、合成生物學(xué)的發(fā)展，厭氧培養(yǎng)技術(shù)將向高通量、自動化、精準(zhǔn)化方向發(fā)展，為厭氧菌的研究與應(yīng)用提供更高效的技術(shù)支撐。
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