如何利用分子生物學(xué)方法進(jìn)行需氧革蘭陽(yáng)性桿菌的鑒定？
小楊 / 2025-10-23 09:51:39
百歐博偉生物：利用分子生物學(xué)方法鑒定需氧革蘭陽(yáng)性桿菌，是通過(guò)分析細(xì)菌的遺傳物質(zhì)（DNA 或 RNA）特征，實(shí)現(xiàn)對(duì)菌種的精準(zhǔn)區(qū)分，尤其適用于傳統(tǒng)生化方法難以鑒定的菌株（如少見菌種、變異株或表型不典型菌株）。以下是常用的分子生物學(xué)技術(shù)及其應(yīng)用細(xì)節(jié)：
一、基于核酸序列分析的鑒定技術(shù)
1、16S rRNA 基因測(cè)序（金標(biāo)準(zhǔn)之一）
原理：16S rRNA 基因是細(xì)菌核糖體小亞基的編碼基因，具有高度保守性（便于設(shè)計(jì)通用引物）和可變區(qū)（可區(qū)分不同菌種），其序列差異可反映細(xì)菌的進(jìn)化關(guān)系。
操作流程：
提取細(xì)菌基因組 DNA；
用通用引物擴(kuò)增 16S rRNA 基因全長(zhǎng)或可變區(qū)；
對(duì) PCR 產(chǎn)物測(cè)序，將序列與已知數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，通過(guò)序列同源性（通常≥97% 為同一種，≥95% 為同一屬）確定菌種。
優(yōu)勢(shì)：適用范圍廣，可鑒定絕大多數(shù)需氧革蘭陽(yáng)性桿菌（如
芽孢桿菌屬、
棒狀桿菌屬、
李斯特菌屬等），是分類學(xué)研究的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。
局限性：部分近緣菌種（如
單核細(xì)胞增生李斯特菌與伊氏李斯特菌）的 16S rRNA 基因序列差異小，可能需要結(jié)合其他基因分析。
2、特異性基因擴(kuò)增與測(cè)序
針對(duì)某些菌屬/菌種的特有基因設(shè)計(jì)引物，通過(guò) PCR 擴(kuò)增并測(cè)序，實(shí)現(xiàn)特異性鑒定：
炭疽芽孢桿菌：檢測(cè)編碼莢膜抗原的pag基因、編碼致死因子的lef基因或保護(hù)性抗原基因pagA，這些基因是炭疽桿菌特有的，可快速區(qū)分于其他芽孢桿菌。
白喉棒狀桿菌：檢測(cè)編碼白喉毒素的tox基因，不僅可鑒定菌種，還能判斷其產(chǎn)毒性。
單核細(xì)胞增生李斯特菌：檢測(cè)hly基因（編碼溶血素）或inlA基因（編碼內(nèi)化素），特異性區(qū)分于李斯特菌屬的其他菌種。
優(yōu)勢(shì)：針對(duì)性強(qiáng)，靈敏度高，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)“鑒定 + 毒力判斷”。
3、多位點(diǎn)序列分型（MLST）
原理：選取細(xì)菌基因組中多個(gè)管家基因，擴(kuò)增并測(cè)序，通過(guò)分析多個(gè)基因的序列變異，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，區(qū)分親緣關(guān)系近的菌種或菌株分型。
應(yīng)用：常用于需氧革蘭陽(yáng)性桿菌的流行病學(xué)調(diào)查（如追蹤
芽孢桿菌屬的暴發(fā)流行株），或區(qū)分傳統(tǒng)方法難以鑒別的近緣種（如
棒狀桿菌屬的不同菌種）。
二、基于核酸雜交的鑒定技術(shù)
1、核酸探針雜交
原理：設(shè)計(jì)與目標(biāo)菌特有核酸序列互補(bǔ)的探針，通過(guò)雜交信號(hào)（如熒光、放射性標(biāo)記）判斷是否存在目標(biāo)菌。
應(yīng)用：
檢測(cè)白喉棒狀桿菌的tox基因探針，快速確認(rèn)產(chǎn)毒菌株；
針對(duì)蠟樣芽孢桿菌的特異性探針，區(qū)分于其他芽孢桿菌。
優(yōu)勢(shì)：操作相對(duì)簡(jiǎn)便，特異性高；局限性：通量較低，一次通常只能檢測(cè)一種目標(biāo)菌。
2、基因芯片技術(shù)
原理：將多種細(xì)菌的特異性基因探針固定在芯片上，與待檢菌的核酸（經(jīng)熒光標(biāo)記）雜交，通過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)度分析，同時(shí)鑒定多種細(xì)菌。
應(yīng)用：可同時(shí)檢測(cè)需氧革蘭陽(yáng)性桿菌的多個(gè)標(biāo)志性基因，實(shí)現(xiàn)高通量快速鑒定（如同時(shí)區(qū)分
芽孢桿菌、
李斯特菌、
棒狀桿菌）。
優(yōu)勢(shì)：高效、快速，適合批量樣本；局限性：成本較高，依賴已知探針設(shè)計(jì)。
三、質(zhì)譜技術(shù)（間接分子水平鑒定）
基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜雖不直接分析核酸，但其通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌的蛋白質(zhì)組（尤其是核糖體蛋白）特征峰，實(shí)現(xiàn)分子水平的快速鑒定，已成為臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的主流技術(shù)之一：
原理：細(xì)菌蛋白在質(zhì)譜中形成特征性“指紋圖譜”，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)菌株圖譜比對(duì)，匹配度越高則鑒定可信度越高。
優(yōu)勢(shì)：快速、高效、成本較低（單樣本），適合臨床常規(guī)檢測(cè)；局限性：對(duì)少見或變異菌株的鑒定依賴數(shù)據(jù)庫(kù)完善度。
四、分子生物學(xué)方法的選擇策略
常規(guī)鑒定：優(yōu)先選擇 MALDI-TOF MS（快速、高效）或 16S rRNA 基因測(cè)序（適用范圍廣）。
疑難菌株或流行病學(xué)調(diào)查：采用 MLST 或基因芯片，分析菌株親緣關(guān)系或高通量篩查。
五、總結(jié)
分子生物學(xué)方法通過(guò)直接分析細(xì)菌的遺傳物質(zhì)或蛋白質(zhì)特征，突破了傳統(tǒng)生化方法依賴表型的局限性，顯著提高了需氧革蘭陽(yáng)性桿菌鑒定的準(zhǔn)確性和效率。其中，16S rRNA 基因測(cè)序是分類學(xué)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，是臨床常規(guī)檢測(cè)的首選，而特異性基因 PCR 則在高危菌種鑒定中發(fā)揮關(guān)鍵作用。實(shí)際應(yīng)用中需結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件、樣本類型及鑒定需求，選擇最合適的技術(shù)組合。
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