分子生物學(xué)技術(shù)在微生物檢驗(yàn)中的主要應(yīng)用與未來發(fā)展趨勢！
小楊 / 2025-10-16 10:03:01
百歐博偉生物：分子生物學(xué)技術(shù)以其高靈敏度、高特異性、快速和自動化的優(yōu)勢，徹底改變了傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)的面貌，已成為現(xiàn)代臨床診斷、公共衛(wèi)生和基礎(chǔ)研究的核心工具。
一、與傳統(tǒng)方法的比較：為何需要分子生物學(xué)技術(shù)？
1、傳統(tǒng)方法（培養(yǎng)、鏡檢、生化鑒定）：
優(yōu)點(diǎn)：金標(biāo)準(zhǔn)，可提供活菌用于藥敏試驗(yàn)，成本較低。
缺點(diǎn)：耗時長（數(shù)天至數(shù)周）、靈敏度低（需一定菌量）、對難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的微生物無能為力（如病毒、衣原體、部分真菌）。
2、分子生物學(xué)方法：
優(yōu)點(diǎn)：快速（數(shù)小時）、靈敏度極高（可檢測單個拷貝的基因）、特異性強(qiáng)（精準(zhǔn)識別）、不依賴微生物的培養(yǎng)能力。
缺點(diǎn)：成本較高、無法區(qū)分死菌與活菌（除非使用mRNA靶標(biāo)）、對實(shí)驗(yàn)室條件和人員素質(zhì)要求高、通常無法直接提供藥敏結(jié)果（宏基因組學(xué)除外）。
二、核心分子生物學(xué)技術(shù)及其應(yīng)用
1、核酸擴(kuò)增技術(shù)
這是應(yīng)用最廣泛、最成熟的一類技術(shù)，核心是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。
常規(guī)PCR：
原理：通過引物特異性擴(kuò)增目標(biāo)微生物的特定基因片段。
實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）：
原理：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光探針或染料，實(shí)時監(jiān)測擴(kuò)增過程，通過Ct值對模板進(jìn)行定量分析。
應(yīng)用：
病原體定量：監(jiān)測HIV、HBV、HCV的病毒載量，用于療效評估。
快速診斷：在數(shù)小時內(nèi)檢測呼吸道病原體、胃腸道病原體、中樞神經(jīng)系統(tǒng)病原體等。
耐藥基因檢測：直接檢測臨床樣本中的耐藥基因，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的 mecA 基因、結(jié)核分枝桿菌的利福平耐藥 rpoB 基因突變。
逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）：
原理：先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
應(yīng)用：專門用于檢測RNA病毒，如新型冠狀病毒、丙型肝炎病毒（HCV）、流感病毒等。
等溫擴(kuò)增技術(shù)：
原理：在恒定溫度下進(jìn)行核酸擴(kuò)增，無需昂貴的PCR儀。
代表技術(shù)：環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）、重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）。
應(yīng)用：特別適合現(xiàn)場快速檢測（POCT）、基層醫(yī)院和資源匱乏地區(qū)。
2、核酸雜交技術(shù)
原理：用帶有標(biāo)記的已知序列核酸單鏈（探針）與待測樣本中的互補(bǔ)核酸序列退火形成雙鏈。
應(yīng)用：
熒光原位雜交（FISH）：直接在組織切片或涂片上定位和鑒定微生物，尤其適用于診斷難培養(yǎng)的細(xì)菌。
基因芯片/DNA微陣列：將大量探針固定于芯片上，一次反應(yīng)可同時檢測數(shù)十至數(shù)百種病原體，常用于呼吸道、胃腸道病原體panel的篩查。
3、基因測序技術(shù)
這是最強(qiáng)大的技術(shù)，能提供最完整的遺傳信息。
Sanger測序（第一代）：
應(yīng)用：
菌種鑒定：對16S rRNA基因進(jìn)行測序，是鑒定罕見、疑難細(xì)菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”。
耐藥突變分析：精確分析結(jié)核分枝桿菌、HIV等病原體的耐藥相關(guān)基因突變位點(diǎn)。
下一代測序（NGS）/高通量測序：
應(yīng)用：
宏基因組學(xué)測序（mNGS）：革命性技術(shù)。無需培養(yǎng)，直接對臨床樣本中全部微生物（細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲）的核酸進(jìn)行測序。對于病因不明的重癥感染、新發(fā)突發(fā)傳染病的診斷具有無可替代的價值。
病原體分型與溯源：通過對全基因組進(jìn)行測序，可進(jìn)行高分辨力的分子分型，用于醫(yī)院感染暴發(fā)、食源性疾病暴發(fā)的溯源調(diào)查。
耐藥基因組學(xué)：通過分析全基因組序列，預(yù)測其完整的耐藥譜。
4、蛋白質(zhì)和質(zhì)譜技術(shù)
雖然屬于蛋白層面，但其發(fā)展依賴于基因組數(shù)據(jù)庫，常與分子技術(shù)聯(lián)用。
MALDI-TOF質(zhì)譜：
原理：獲得微生物自身蛋白質(zhì)的“指紋圖譜”，與數(shù)據(jù)庫比對進(jìn)行快速鑒定。
應(yīng)用：已取代大部分生化鑒定，成為臨床微生物實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌、酵母樣真菌鑒定的主流技術(shù)，可在數(shù)分鐘內(nèi)完成。
三、主要應(yīng)用領(lǐng)域總結(jié)
病原體快速檢測與鑒定：取代或補(bǔ)充傳統(tǒng)培養(yǎng)，尤其適用于難培養(yǎng)、生長緩慢或危險的病原體。
流行病學(xué)與感染控制：通過分子分型追蹤傳染源和傳播途徑，控制醫(yī)院內(nèi)感染暴發(fā)。
耐藥性檢測：直接檢測耐藥基因或通過測序預(yù)測耐藥表型，指導(dǎo)臨床精準(zhǔn)用藥。
病毒載量監(jiān)測：定量監(jiān)測抗病毒治療的效果。
新發(fā)傳染病病原體的發(fā)現(xiàn)與鑒定：mNGS等技術(shù)在發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒、SARS病毒等過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
四、未來發(fā)展趨勢
即時檢測（POCT）：開發(fā)更小型、快速、自動化的分子診斷設(shè)備，使檢測在床旁、社區(qū)甚至家庭中完成。
多重PCR與微流控技術(shù)結(jié)合：在一個芯片上實(shí)現(xiàn)從樣本處理到多重檢測的全自動化，一次檢測一個樣本中的數(shù)十種病原體。
生物信息學(xué)與人工智能：隨著NGS的普及，如何高效、準(zhǔn)確地分析和解讀海量測序數(shù)據(jù)成為關(guān)鍵，AI將發(fā)揮越來越重要的作用。
宿主反應(yīng)診斷：不僅檢測病原體，還通過分析宿主的基因表達(dá)譜來區(qū)分感染與非感染、判斷感染嚴(yán)重程度和預(yù)后。
總之，分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)成為微生物檢驗(yàn)領(lǐng)域不可或缺的支柱，它極大地提升了我們診斷和應(yīng)對感染性疾病的能力，并正朝著更快速、更全面、更精準(zhǔn)和更智能的方向飛速發(fā)展。
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