細(xì)胞冷凍保存法與解凍培養(yǎng)技巧及常見問題有哪些？
小楊 / 2025-10-13 10:37:01
百歐博偉生物：細(xì)胞冷凍保存與解凍培養(yǎng)是細(xì)胞生物學(xué)研究和臨床應(yīng)用中的核心技術(shù)，其核心目標(biāo)是最大限度減少低溫?fù)p傷（如冰晶形成、滲透壓變化），維持細(xì)胞活性與功能。以下將從冷凍保存方法、解凍操作、關(guān)鍵技巧及常見問題四個(gè)維度展開詳細(xì)說明。
一、細(xì)胞冷凍保存：從準(zhǔn)備到凍存的完整流程
細(xì)胞冷凍的核心邏輯是：通過低溫保護(hù)劑（CPA）降低細(xì)胞內(nèi)冰點(diǎn)、減少冰晶形成，結(jié)合梯度降溫（避免溫度驟變導(dǎo)致細(xì)胞破裂），最終實(shí)現(xiàn)長期（數(shù)月至數(shù)年）液氮（-196℃）保存。
1、凍存前核心準(zhǔn)備
凍存成功的前提是“細(xì)胞狀態(tài)良好”，需嚴(yán)格把控以下環(huán)節(jié)：
細(xì)胞質(zhì)量檢測(cè)：
確保細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期（匯合度 70%-80%），此時(shí)細(xì)胞增殖活躍、抗損傷能力強(qiáng)；避免使用衰老（匯合度過高）或污染（細(xì)菌、真菌、支原體）的細(xì)胞。
凍存前 1-2 天更換新鮮培養(yǎng)基，保證細(xì)胞營養(yǎng)充足。
試劑準(zhǔn)備：
低溫保護(hù)劑（CPA）：最常用“二甲基亞砜（DMSO）+ 胎牛血清（FBS）+ 基礎(chǔ)培養(yǎng)基”體系，DMSO 終濃度通常為 10%（高濃度 DMSO 有細(xì)胞毒性，需現(xiàn)配現(xiàn)用）。
示例配方（1mL 凍存液）：800μL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
特殊細(xì)胞適配：對(duì) DMSO 敏感的細(xì)胞（如某些
干細(xì)胞、
原代細(xì)胞），可替換為 10%-20% 甘油或?qū)Ｓ脽o血清凍存液。
耗材：無菌凍存管（2mL，提前標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期）、離心管、移液槍及槍頭（均需無菌處理）。
設(shè)備準(zhǔn)備：超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、生物安全柜、梯度降溫盒（或程序降溫儀）、液氮罐（確保液氮充足，液面覆蓋凍存管）。
2、主流冷凍保存方法
根據(jù)降溫速度控制方式，分為“程序降溫法”（金標(biāo)準(zhǔn)，適用于絕大多數(shù)細(xì)胞）和“簡易降溫法”（僅適用于耐受性強(qiáng)的細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞系）。
方法類型 核心原理 操作步驟 適用場(chǎng)景 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)
程序降溫法 可編程控制降溫速率（通常 1℃/min），逐步降低細(xì)胞內(nèi)外溫度，減少冰晶形成 1.消化收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，1000rpm 離心 5min，棄上清；2.用預(yù)冷凍存液重懸細(xì)胞；3.分裝至凍存管，放入程序降溫儀；4.設(shè)定程序：4℃平衡 10min → 1℃/min 降至 - 80℃ → 維持 1-2h → 轉(zhuǎn)移至液氮（-196℃） 干細(xì)胞、原代細(xì)胞、敏感細(xì)胞系 細(xì)胞存活率高（通常 > 80%）、穩(wěn)定性好 依賴程序降溫儀（設(shè)備成本高）
簡易降溫法 利用“絕緣材料梯度降溫”，模擬 1℃/min 速率 1.同程序降溫法步驟 1-2；2.凍存管放入泡沫盒（或厚毛巾包裹）；3.直接置于 - 80℃冰箱，靜置 12-24h；4.轉(zhuǎn)移至液氮長期保存 耐受性強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞系 無需特殊設(shè)備、操作簡便 降溫速率不穩(wěn)定，細(xì)胞存活率較低（60%-70%）
3、長期保存注意事項(xiàng)
液氮罐分為“液相保存”（凍存管完全浸入液氮，溫度穩(wěn)定，適合長期）和“氣相保存”（凍存管懸于液氮上方，避免凍存管破裂污染，適合短期），根據(jù)需求選擇。
定期檢查液氮液位（每周至少 1 次），避免液位過低導(dǎo)致凍存管暴露（溫度回升會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)蘇失?。?/div>
凍存管需使用耐低溫材質(zhì)，避免普通 EP 管（低溫下易脆裂）。
二、細(xì)胞解凍培養(yǎng)：快速復(fù)蘇，減少損傷
解凍的核心原則是“快速升溫”（避免細(xì)胞在“危險(xiǎn)溫度區(qū)”（-5℃~0℃）停留過久，減少冰晶重結(jié)晶損傷），同時(shí)“逐步稀釋低溫保護(hù)劑”（避免滲透壓驟變導(dǎo)致細(xì)胞腫脹破裂）。
1、解凍前準(zhǔn)備
預(yù)熱培養(yǎng)基：將含血清的完全培養(yǎng)基（與凍存時(shí)基礎(chǔ)培養(yǎng)基一致）置于 37℃水浴鍋中，預(yù)熱至 37℃（避免冷培養(yǎng)基刺激細(xì)胞）。
準(zhǔn)備耗材：無菌離心管、培養(yǎng)皿 / 瓶、移液槍、PBS（用于洗滌），均需在超凈工作臺(tái)內(nèi)滅菌處理。
安全防護(hù)：DMSO 在室溫下易揮發(fā)，操作時(shí)需戴手套、口罩，在通風(fēng)櫥或生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。
2、標(biāo)準(zhǔn)解凍流程（關(guān)鍵步驟）
快速升溫：從液氮中取出凍存管，立即放入 37℃水浴鍋，持續(xù)輕輕搖晃（使凍存管均勻受熱），1-2min 內(nèi)完全融化（直至管內(nèi)無冰晶殘留，避免過度加熱導(dǎo)致細(xì)胞燙傷）。
無菌處理：用 75% 酒精擦拭凍存管外壁（消毒），移入超凈工作臺(tái)，打開管蓋。
逐步稀釋：用移液槍將融化的細(xì)胞懸液（約 1mL）緩慢滴入含 5-10mL 預(yù)熱培養(yǎng)基的離心管中（滴加速度 1-2 滴 / 秒，邊滴邊輕輕搖晃，稀釋 DMSO 濃度）。
離心洗滌：1000rpm 離心 5min，棄上清（去除殘留 DMSO，減少毒性）；若細(xì)胞對(duì) DMSO 敏感，可重復(fù)洗滌 1 次（用 5mL 培養(yǎng)基重懸后再次離心）。
重懸培養(yǎng)：用 2-3mL 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，吹打均勻（避免用力吹打?qū)е录?xì)胞破碎），轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿 / 瓶中，標(biāo)記細(xì)胞信息。
孵育觀察：將培養(yǎng)皿放入 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱，靜置 24h（避免早期頻繁觀察，減少環(huán)境干擾）；24h 后更換新鮮培養(yǎng)基（去除死亡細(xì)胞及殘留 DMSO），后續(xù)按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)流程維護(hù)。
三、關(guān)鍵技巧與常見問題解決方案
1、提升細(xì)胞存活率的核心技巧
凍存液現(xiàn)配現(xiàn)用：DMSO 在室溫下易氧化產(chǎn)生有毒物質(zhì)，且長時(shí)間放置會(huì)降低保護(hù)效果，建議凍存前 30min 內(nèi)配制。
細(xì)胞濃度適配：凍存濃度過高（>1×10? cells/mL）易導(dǎo)致細(xì)胞聚團(tuán)死亡，過低（<1×10? cells/mL）則復(fù)蘇后增殖緩慢，常規(guī)控制在 1×10?-1×10? cells/mL。
解凍后“不離心”特殊情況：對(duì)離心敏感的細(xì)胞（如某些懸浮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞），可省略離心步驟，直接將融化的細(xì)胞懸液滴入大量預(yù)熱培養(yǎng)基（1:10 比例稀釋），24h 后更換培養(yǎng)基（間接去除 DMSO）。
避免反復(fù)凍融：細(xì)胞解凍后需一次性培養(yǎng)，不可再次凍存（反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性急劇下降，甚至全部死亡）。
2、常見問題與解決方案
常見問題 可能原因 解決方案
解凍后細(xì)胞存活率低（<50%） 1.凍存時(shí)細(xì)胞處于非對(duì)數(shù)期；2.降溫速率過快/過慢；3.解凍時(shí)間過長 1.確保凍存細(xì)胞為對(duì)數(shù)生長期；2.采用程序降溫法，嚴(yán)格控制 1℃/min；3.37℃水浴快速融化（1-2min 內(nèi)）
細(xì)胞復(fù)蘇后聚團(tuán)嚴(yán)重 1.凍存液中細(xì)胞濃度過高；2.解凍后吹打不充分；3.培養(yǎng)基中血清濃度不足 1.調(diào)整凍存濃度至 1×10?-1×10? cells/mL；2.輕柔吹打 5-10 次（避免產(chǎn)生氣泡）；3.提高血清濃度至 15%-20%（促進(jìn)細(xì)胞貼壁分散）
細(xì)胞復(fù)蘇后不貼壁（貼壁細(xì)胞） 1. 培養(yǎng)皿未包被（針對(duì)原代細(xì)胞/干細(xì)胞）；2.解凍后培養(yǎng)基更換過晚；3.細(xì)胞凍存時(shí)間過長 1. 用明膠、多聚賴氨酸包被培養(yǎng)皿；2.24h 內(nèi)及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基；3.凍存時(shí)間不超過 1 年（長期保存需定期復(fù)蘇檢測(cè)）
復(fù)蘇后細(xì)胞污染 1.凍存管解凍前消毒不徹底；2.液氮罐內(nèi)有污染（如凍存管破裂） 1.75% 酒精擦拭凍存管外壁至少 30 秒；2.定期清潔液氮罐，發(fā)現(xiàn)破裂凍存管立即移除
四、總結(jié)
細(xì)胞冷凍與解凍的核心是“低溫保護(hù)劑 + 梯度降溫（凍存）”和“快速升溫 + 逐步稀釋（解凍）”，兩者需緊密配合。對(duì)于敏感細(xì)胞（如
干細(xì)胞、
原代細(xì)胞），優(yōu)先選擇“程序降溫法 + 嚴(yán)格解凍流程”；對(duì)于常規(guī)細(xì)胞系，可采用“簡易降溫法”降低成本。同時(shí)，全程需嚴(yán)格無菌操作，把控細(xì)胞狀態(tài)、試劑質(zhì)量和溫度控制三個(gè)關(guān)鍵變量，才能最大限度維持細(xì)胞活性與功能。
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