微生物常規(guī)鑒定技術(shù)之生理生化試驗的類型及操作要點！
小楊 / 2025-09-26 10:08:14
百歐博偉生物：微生物常規(guī)鑒定中的生理生化試驗，是通過檢測微生物在代謝過程中對營養(yǎng)物質(zhì)的利用能力、產(chǎn)物分泌特性及酶活性差異，來區(qū)分和鑒定不同種類微生物的核心技術(shù)，尤其適用于細菌（如
革蘭陰性桿菌、
葡萄球菌等）的分類鑒定。
一、核心原理：利用“代謝差異”區(qū)分微生物
不同微生物的基因決定了其代謝酶系統(tǒng)的差異，這種差異會直接體現(xiàn)在：
是否能利用特定碳源（如葡萄糖、乳糖）或氮源（如銨鹽、硝酸鹽）；
代謝過程中是否產(chǎn)生特殊產(chǎn)物（如酸、氣體、色素、硫化氫）；
是否具備特定酶活性（如氧化酶、過氧化氫酶、脲酶）。
通過觀察微生物在標準化培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)或反應(yīng)結(jié)果（如顏色變化、氣體產(chǎn)生），即可反向推斷其種類，例如：
大腸埃希菌能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，而
沙門氏菌不能發(fā)酵乳糖，這一差異是兩者鑒定的關(guān)鍵依據(jù)。
二、常見生理生化試驗類型及操作要點
根據(jù)檢測目的不同，生理生化試驗可分為“碳源利用試驗”“氮源利用試驗”“酶活性試驗”“特殊產(chǎn)物試驗”四大類，每類包含多個常用項目。
1、碳源利用試驗：檢測微生物對糖類的代謝能力
糖類是微生物最主要的碳源，其發(fā)酵能力（產(chǎn)酸 / 產(chǎn)氣）是細菌鑒定的核心指標，尤其適用于腸道桿菌（如
大腸埃希菌、
沙門氏菌）的區(qū)分。
2、氮源利用試驗：檢測微生物對含氮化合物的代謝能力
主要用于區(qū)分不同細菌對硝酸鹽、銨鹽等氮源的利用，以及是否產(chǎn)生特定含氮產(chǎn)物。
硝酸鹽還原試驗：
原理：檢測細菌是否能將培養(yǎng)基中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽（或進一步還原為氮氣、氨）；
操作：接種細菌到硝酸鹽培養(yǎng)基，培養(yǎng)后加入“對氨基苯磺酸 +α- 萘胺”試劑；
結(jié)果：若變紅，說明還原產(chǎn)生亞硝酸鹽（陽性）；若不變紅，需加鋅粉（若鋅粉使培養(yǎng)基變紅，說明硝酸鹽未被還原，陰性；若仍不變紅，說明硝酸鹽被還原為其他產(chǎn)物，陽性）。
吲哚試驗：
原理：檢測細菌是否能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚；
操作：接種細菌到蛋白胨水培養(yǎng)基（含色氨酸），培養(yǎng)后加入“對二甲基氨基苯甲醛 + 濃鹽酸”；
結(jié)果：若上層出現(xiàn)玫瑰紅色，為陽性（如
大腸埃希菌）；無顏色變化為陰性（如
沙門氏菌）。
3、酶活性試驗：檢測微生物是否具備特定代謝酶
通過酶與底物的特異性反應(yīng)（如顏色變化、氣泡產(chǎn)生），快速判斷酶活性，是細菌鑒定的“快速指標”。
氧化酶試驗：
原理：檢測細菌是否產(chǎn)生細胞色素氧化酶（參與有氧呼吸電子傳遞）；
操作：用無菌棉簽蘸取純培養(yǎng)菌，涂抹在含氧化酶試劑（如四甲基對苯二胺）的濾紙上；
結(jié)果：10 秒內(nèi)濾紙變藍紫色為陽性（如
銅綠假單胞菌）；超過 10 秒或不變色為陰性（如
大腸埃希菌）。
過氧化氫酶試驗（觸酶試驗）：
原理：檢測細菌是否產(chǎn)生過氧化氫酶（分解過氧化氫產(chǎn)生氧氣）；
操作：取純培養(yǎng)菌涂于載玻片，滴加 3% 過氧化氫溶液；
結(jié)果：產(chǎn)生氣泡為陽性（如
葡萄球菌）；無氣泡為陰性（如
鏈球菌，可用于兩者區(qū)分）。
脲酶試驗：
原理：檢測細菌是否產(chǎn)生脲酶（分解尿素產(chǎn)生氨，使培養(yǎng)基 pH 升高）；
操作：接種細菌到脲酶培養(yǎng)基（含尿素、酚紅指示劑，酸性呈黃色，堿性呈紅色）；
4、特殊產(chǎn)物試驗：檢測微生物代謝的特征性產(chǎn)物
主要用于區(qū)分特定類群的微生物，如“硫化氫試驗”“枸櫞酸鹽利用試驗”等。
硫化氫試驗：
原理：檢測細菌是否能分解含硫氨基酸（如半胱氨酸）產(chǎn)生硫化氫，硫化氫會與培養(yǎng)基中的鐵離子（如硫酸亞鐵）形成黑色硫化亞鐵；
操作：接種細菌到硫化氫培養(yǎng)基（如 SS 瓊脂、克氏鐵瓊脂）；
結(jié)果：培養(yǎng)基出現(xiàn)黑色沉淀為陽性（如
沙門氏菌）；無黑色為陰性（如
大腸埃希菌）。
枸櫞酸鹽利用試驗：
原理：檢測細菌是否能以枸櫞酸鹽為唯一碳源生長，并分解枸櫞酸鹽產(chǎn)生碳酸鈉（使培養(yǎng)基 pH 升高）；
操作：接種細菌到枸櫞酸鹽培養(yǎng)基（含枸櫞酸鈉、溴麝香草酚藍指示劑，酸性呈綠色，堿性呈藍色）；
三、試驗注意事項：確保結(jié)果準確的關(guān)鍵
接種純培養(yǎng)菌：試驗必須使用純培養(yǎng)物（單一菌種），若有雜菌污染，會導致結(jié)果混亂（如雜菌產(chǎn)酸可能掩蓋目標菌的陰性結(jié)果）。
嚴格控制培養(yǎng)條件：溫度（通常 35-37℃）、時間（18-24 小時，部分試驗需延長至 48 小時）需標準化，例如：脲酶試驗若培養(yǎng)時間不足，可能出現(xiàn)“假陰性”。
試劑新鮮與規(guī)范添加：
指示劑需在有效期內(nèi)使用，且按說明書比例添加（如吲哚試劑需滴加 3-5 滴，過少可能不顯色）；
氧化酶試劑易氧化失效，需現(xiàn)配現(xiàn)用。
結(jié)果判讀及時：部分試驗結(jié)果（如氧化酶試驗、糖發(fā)酵試驗的產(chǎn)酸結(jié)果）需在培養(yǎng)后 1 小時內(nèi)判讀，避免長時間放置導致顏色消退或雜菌污染。
結(jié)合其他鑒定手段：生理生化試驗結(jié)果需結(jié)合“形態(tài)學特征”（如革蘭染色結(jié)果、菌落形態(tài)）、“分子生物學檢測”等綜合判斷，避免單一試驗結(jié)果誤判。
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