微生物試劑無(wú)菌性測(cè)試的具體操作步驟及結(jié)果觀察與判斷！
小楊 / 2025-09-05 10:19:35
百歐博偉生物：微生物試劑的無(wú)菌性測(cè)試是確保試劑（如培養(yǎng)基、稀釋液、緩沖液、生物指示劑載體等）在使用前未被微生物污染的關(guān)鍵步驟，核心是通過模擬實(shí)際使用條件的培養(yǎng)的培養(yǎng)，檢測(cè)是否存在活菌。以下是基于《中華人民共和國(guó)藥典》（ChP）、《美國(guó)藥典》（USP）或《歐洲藥典》（EP）等權(quán)威標(biāo)準(zhǔn)的通用操作步驟，具體需結(jié)合試劑類型（如液體、固體、油劑）和藥典版本調(diào)整：
一、測(cè)試前準(zhǔn)備：環(huán)境與物料控制
無(wú)菌測(cè)試需在Class 100（A 級(jí)）潔凈環(huán)境下進(jìn)行（如生物安全柜、無(wú)菌隔離器），且所有接觸試劑的器具需提前滅菌（如高壓蒸汽滅菌、干熱滅菌），避免外源污染干擾結(jié)果。
環(huán)境驗(yàn)證：確認(rèn) A 級(jí)潔凈區(qū)的懸浮粒子、沉降菌符合標(biāo)準(zhǔn)（如 ChP 要求懸浮粒子≥0.5μm 的粒子數(shù)≤3500 個(gè) /m³，≥5.0μm 的粒子數(shù)≤20 個(gè) /m³），并記錄環(huán)境監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)。
器具滅菌：
玻璃器皿（如錐形瓶、移液管、培養(yǎng)皿）：121℃高壓蒸汽滅菌 20 分鐘，或 160-170℃干熱滅菌 2-4 小時(shí)；
塑料器具（如無(wú)菌吸頭、離心管）：選擇已滅菌的一次性產(chǎn)品，或確認(rèn)可耐受的滅菌方式（如 γ 射線滅菌）；
稀釋液 / 沖洗液（如 0.9% 無(wú)菌氯化鈉溶液）：需單獨(dú)做無(wú)菌性驗(yàn)證，確保自身無(wú)菌。
人員準(zhǔn)備：操作人員需穿戴無(wú)菌服、手套、口罩，手部消毒后進(jìn)入潔凈區(qū)，操作前通過“無(wú)菌模擬試驗(yàn)”（如用無(wú)菌培養(yǎng)基模擬操作流程，培養(yǎng)后無(wú)菌生長(zhǎng)）確認(rèn)操作合規(guī)性。
二、樣品處理：根據(jù)試劑形態(tài)選擇方法
需根據(jù)微生物試劑的物理形態(tài)（液體、固體、油劑、膜劑等）設(shè)計(jì)處理方式，核心是讓可能存在的污染菌充分釋放到培養(yǎng)基中，同時(shí)不破壞試劑穩(wěn)定性。
試劑類型 處理方法
液體試劑（如稀釋液、液體培養(yǎng)基） 直接取樣：用無(wú)菌移液管吸取 10-20mL 樣品（或按試劑說明書規(guī)定體積），分別接種至需氧、厭氧、真菌培養(yǎng)基。
固體試劑（如固體培養(yǎng)基粉末、凍干試劑） 復(fù)溶/溶解：用無(wú)菌稀釋液（如 0.9% 無(wú)菌氯化鈉）按說明書比例復(fù)溶，制成均勻液體后，取 10-20mL 接種培養(yǎng)基。
油劑/脂溶性試劑（如石蠟、油相緩沖液） 乳化處理：加入無(wú)菌乳化劑（如聚山梨酯 80）或無(wú)菌稀釋液，在無(wú)菌條件下攪拌乳化，使油相分散，再取乳化液接種。
膜劑/吸附型試劑（如無(wú)菌濾膜、生物指示劑載體） 沖洗/浸泡：將樣品放入無(wú)菌錐形瓶，加入足量無(wú)菌沖洗液，振蕩或浸泡 30 分鐘，取沖洗液接種培養(yǎng)基。
三、培養(yǎng)基選擇與接種：覆蓋所有可能污染菌
無(wú)菌測(cè)試需覆蓋需氧菌、厭氧菌、真菌三類微生物，因此需選擇針對(duì)性培養(yǎng)基，并采用“直接接種法”或“薄膜過濾法”（適用于含抑菌成分的試劑）接種。
1、常用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
微生物類型 培養(yǎng)基舉例 培養(yǎng)溫度 培養(yǎng)時(shí)間 觀察指標(biāo)
需氧菌 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB） 30-35℃ ≥14 天 培養(yǎng)基渾濁、產(chǎn)生沉淀或氣泡
厭氧菌 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（FTM） 30-35℃ ≥14 天 培養(yǎng)基（還原層）渾濁
真菌 沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB） 20-25℃ ≥14 天 培養(yǎng)基渾濁、產(chǎn)生菌絲
2、接種操作（以直接接種法為例）
取 3 份待測(cè)試劑樣品（每份體積按說明書規(guī)定，如 10mL），分別接種至需氧菌培養(yǎng)基、厭氧菌培養(yǎng)基、真菌培養(yǎng)基中；
同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（接種已知菌，如需氧菌用
金黃色葡萄球菌、厭氧菌用
生孢梭菌、真菌用
白色念珠菌）和陰性對(duì)照（僅接種無(wú)菌培養(yǎng)基，無(wú)樣品）；
接種后輕輕搖勻培養(yǎng)基，按上述條件避光培養(yǎng)（厭氧菌需在厭氧培養(yǎng)箱或厭氧袋中培養(yǎng)，避免氧氣干擾）。
四、結(jié)果觀察與判斷：排除假陽(yáng)性 / 假陰性
培養(yǎng)期間需定期（如第 7 天、第 14 天）觀察培養(yǎng)基狀態(tài)，重點(diǎn)關(guān)注“是否有微生物生長(zhǎng)跡象”，并結(jié)合對(duì)照結(jié)果判斷：
1、對(duì)照結(jié)果有效性判斷
陽(yáng)性對(duì)照：培養(yǎng)后需出現(xiàn)明顯微生物生長(zhǎng)（如 TSB 渾濁、FTM 還原層渾濁），證明培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件有效；
陰性對(duì)照：培養(yǎng)全程需澄清透明，無(wú)任何生長(zhǎng)跡象，證明操作環(huán)境、器具無(wú)外源污染。
若對(duì)照結(jié)果無(wú)效，需重新進(jìn)行無(wú)菌測(cè)試。
2、樣品結(jié)果判斷
合格（無(wú)菌）：待測(cè)試劑對(duì)應(yīng)的 3 種培養(yǎng)基均澄清透明，無(wú)任何微生物生長(zhǎng)跡象，且對(duì)照結(jié)果有效；
不合格（有菌）：任一培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁、沉淀、氣泡、菌絲等生長(zhǎng)跡象，需進(jìn)一步驗(yàn)證（如取渾濁培養(yǎng)基劃線接種至固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)后觀察菌落形態(tài)，確認(rèn)是否為污染菌）；
可疑結(jié)果：若培養(yǎng)基出現(xiàn)輕微渾濁，但無(wú)法確定是否為微生物生長(zhǎng)，可延長(zhǎng)培養(yǎng)至 21 天，或取樣品重新測(cè)試，若仍有可疑跡象，判定為不合格。
五、異常情況處理與記錄
污染溯源：若樣品測(cè)試不合格，需排查污染來源（如試劑生產(chǎn)過程、儲(chǔ)存環(huán)節(jié)、測(cè)試操作污染），并記錄溯源過程；
重新測(cè)試：僅當(dāng)“明確污染由測(cè)試操作失誤導(dǎo)致”（如陰性對(duì)照污染）時(shí)，可重新取樣測(cè)試；若懷疑試劑本身污染，需擴(kuò)大取樣量（如取 3 倍批量樣品）重復(fù)測(cè)試；
記錄存檔：完整記錄測(cè)試過程，包括環(huán)境監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)、樣品信息、培養(yǎng)基批次、培養(yǎng)條件、觀察結(jié)果、對(duì)照情況等，存檔至少 3 年（或符合法規(guī)要求的保存期限）。
六、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
抑菌成分干擾：若試劑含抑菌劑（如抗生素、防腐劑），直接接種會(huì)抑制污染菌生長(zhǎng)，導(dǎo)致假陰性，需采用薄膜過濾法（用無(wú)菌濾膜截留樣品中的微生物，再將濾膜轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基培養(yǎng)，去除抑菌成分干擾）；
培養(yǎng)基適用性驗(yàn)證：每次使用新批次培養(yǎng)基前，需做“適用性驗(yàn)證”（接種已知菌，確認(rèn)能正常生長(zhǎng)），避免培養(yǎng)基失效；
法規(guī)合規(guī)性：不同國(guó)家/地區(qū)的藥典對(duì)無(wú)菌測(cè)試的細(xì)節(jié)要求略有差異（如培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基配方），需根據(jù)試劑的目標(biāo)市場(chǎng)選擇對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。
通過以上步驟，可科學(xué)、準(zhǔn)確地驗(yàn)證微生物試劑的無(wú)菌性，避免因試劑污染導(dǎo)致后續(xù)實(shí)驗(yàn)（如食品微生物檢測(cè)、藥品無(wú)菌檢查）結(jié)果偏差。
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