病毒載體感染目的細(xì)胞的操作指南及注意事項有哪些？
小楊 / 2025-04-22 10:28:53
百歐博偉生物：使用病毒載體感染目的細(xì)胞是分子生物學(xué)和基因治療中常用的技術(shù)，主要用于基因傳遞、基因編輯或功能研究。以下是詳細(xì)的操作步驟和注意事項：
一、病毒載體選擇
根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇合適的病毒載體類型：
1、腺病毒（Adenovirus）：感染分裂和非分裂細(xì)胞，瞬時表達(dá)（不整合到基因組）。
2、腺相關(guān)病毒（AAV）：低免疫原性，長期表達(dá)（需輔助病毒），適合體內(nèi)實驗。
3、慢病毒（Lentivirus）：感染分裂和非分裂細(xì)胞，整合到基因組，穩(wěn)定表達(dá)。
4、逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus）：僅感染分裂細(xì)胞，整合到基因組。
二、實驗前準(zhǔn)備
1、細(xì)胞準(zhǔn)備：
確保目的細(xì)胞處于對數(shù)生長期（70-90%匯合度）。
提前更換新鮮培養(yǎng)基（避免抗生素，可能影響病毒感染效率）。
2、病毒儲存與稀釋：
病毒液分裝后保存于-80℃，避免反復(fù)凍融。
使用前在冰上緩慢解凍，稀釋時用含血清或（增強(qiáng)感染）的培養(yǎng)基。
三、感染步驟
1、預(yù)實驗優(yōu)化：
確定MOI（Multiplicity of Infection）：通過梯度稀釋病毒（如MOI=1, 5, 10）測試，選擇既能高效感染又避免細(xì)胞毒性的條件。
檢測細(xì)胞敏感性：某些細(xì)胞（如原代細(xì)胞）可能需要更高M(jìn)OI或增強(qiáng)劑。
2、正式感染流程：
將稀釋后的病毒液加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕柔混勻。
離心感染法（提高效率）：
加入病毒液后，將培養(yǎng)板在37℃、1000×g離心30分鐘。
繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時或過夜后更換新鮮培養(yǎng)基。
常規(guī)感染法：
直接加入病毒液，37℃孵育12-24小時。
更換含正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
3、時間控制：
表達(dá)時間因病毒而異（如慢病毒需48-72小時，腺病毒24-48小時）。
四、感染后檢測
1、熒光標(biāo)記檢測：
若病毒攜帶GFP/RFP等報告基因，通過熒光顯微鏡觀察感染效率。
2、qPCR或流式細(xì)胞術(shù)：
定量檢測目標(biāo)基因的表達(dá)水平。
3、功能性驗證：
如基因敲除/過表達(dá)后檢測表型變化（Western blot、細(xì)胞增殖等）。
五、注意事項
1、生物安全：
慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒需在BSL-2級實驗室操作。
穿戴防護(hù)裝備（手套、護(hù)目鏡），廢液需消毒處理。
2、污染控制：
使用無菌技術(shù)避免細(xì)菌污染。
3、細(xì)胞狀態(tài)：
細(xì)胞密度過高或狀態(tài)不佳會顯著降低感染效率。
4、增強(qiáng)劑使用：
可提高慢病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒感染效率，但對某些細(xì)胞有毒。
六、常見問題與解決
1、感染效率低：
提高M(jìn)OI或改用離心感染法。
使用增強(qiáng)劑。
2、細(xì)胞死亡：
降低病毒用量，縮短感染時間。
更換為低毒性的病毒載體。
3、無目標(biāo)基因表達(dá)：
確認(rèn)病毒是否攜帶正確的啟動子（如某些啟動子僅在特定細(xì)胞中激活）。
七、應(yīng)用示例
基因治療：用AAV載體遞送凝血因子基因治療血友病。
CRISPR編輯：慢病毒遞送Cas9和sgRNA實現(xiàn)基因敲除。
體外研究：腺病毒過表達(dá)某信號蛋白研究其功能。
通過以上步驟，可高效、安全地利用病毒載體感染目的細(xì)胞。具體操作需根據(jù)實驗?zāi)康暮图?xì)胞類型靈活調(diào)整。
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