小鼠肺微血管周細(xì)胞的培養(yǎng)操作及作用研究！
小楊 / 2024-04-12 08:55:59
一、背景
小鼠肺微血管周細(xì)胞是一種在肺部微血管周圍分布的細(xì)胞，也稱為肺微血管平滑肌細(xì)胞。它們的主要功能是調(diào)節(jié)肺部微血管的張力和通透性，以維持正常的肺功能。
肺微血管周細(xì)胞是一種圍繞在肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍的細(xì)胞，具有收縮功能。這種細(xì)胞嵌入毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的基膜中，通過物理接觸和旁分泌信號與內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞通訊，監(jiān)視和穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞的成熟過程。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，周細(xì)胞包圍著內(nèi)皮細(xì)胞。
肺微血管周細(xì)胞在肺部疾病中也扮演著重要的角色。例如，在慢性阻塞性肺疾病(COPD)中，肺微血管周細(xì)胞會發(fā)生增殖和遷移，導(dǎo)致肺部微血管收縮和通透性增加，從而加重疾病的進(jìn)展。
此外，肺微血管周細(xì)胞還參與了肺部炎癥和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。它們可以釋放多種細(xì)胞因子和趨化因子，吸引和激活其他免疫細(xì)胞，參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。
1)復(fù)蘇小鼠肺微血管周細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)小鼠肺微血管周細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)小鼠肺微血管周細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
通過培養(yǎng)肺周細(xì)胞，觀察CBDL大鼠血清對肺周細(xì)胞及小鼠肺微血管周細(xì)胞凋亡和caspase-3表達(dá)的影響；觀察CBDL大鼠肺細(xì)胞及小鼠肺微血管周細(xì)胞凋亡、caspase-3表達(dá)情況和周細(xì)胞的主要標(biāo)志蛋白α-平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)、神經(jīng)元膠質(zhì)抗原2(neuron-glial antigen2,NG2)、desmin的蛋白水平及其陽性細(xì)胞率的變化；抑制caspase-3后檢測肺細(xì)胞凋亡，α-SMA、desmin、NG2的蛋白水平及其陽性細(xì)胞率的變化，以及肺微血管擴(kuò)張和血氧交換情況，證明如下假設(shè)：CBDL產(chǎn)生的血清因子變化，通過血液循環(huán)作用于肺微血管，致caspase-3激活，肺周細(xì)胞凋亡，進(jìn)而引起肺微血管擴(kuò)張、血氧交換異常和低氧血癥，最終揭示肺周細(xì)胞凋亡在HPS實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头挝⒀軘U(kuò)張中的重要作用。
方法：
1、CBDL大鼠血清對肺周細(xì)胞及小鼠肺微血管周細(xì)胞凋亡的作用研究1.1肺周細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定。1.2采用CBDL法構(gòu)建HPS大鼠模型，收集CBDL1wk血清。1.3CBDL大鼠血清培養(yǎng)肺周細(xì)胞后，分別用TUNEL和western blot檢測其凋亡和caspase-3表達(dá)情況。
2、CBDL大鼠中肺周細(xì)胞的變化研究2.1采用CBDL法構(gòu)建HPS大鼠模型。2.2分別用TUNEL和western blot檢測CBDL大鼠肺細(xì)胞的凋亡和caspase-3的表達(dá)。2.3分別用western blot和免疫組化法檢測CBDL大鼠肺α-SMA、desmin、NG2的蛋白水平及其陽性細(xì)胞率的變化。
3、抑制caspase-3對CBDL大鼠肺周細(xì)胞的影響及HPS的作用研究3.1采用CBDL法構(gòu)建HPS大鼠模型，手術(shù)后第一天起每天給模型大鼠腹腔注射caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK，連續(xù)2wk。3.2用TUNEL法檢測抑制caspase-3后CBDL大鼠肺細(xì)胞的凋亡情況。3.3分別用western blot和免疫組化法檢測抑制caspase-3后CBDL大鼠肺α-SMA、desmin、NG2的蛋白水平及其陽性細(xì)胞率的變化。3.4分別用血?dú)夥治龊虷E染色法觀察抑制caspase-3后CBDL大鼠血氧交換和肺微血管擴(kuò)張情況。
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