MEF P0細(xì)胞培養(yǎng)Protocol
復(fù)蘇：
1,將MEF P0細(xì)胞凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺2,內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
3,將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含3-4 ml MEF完全培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi)，以1000 rpm,離心5 min。
4,離心后將上清液吸除，另加入新鮮的MEF完全培養(yǎng)液2 ml，吹打懸浮。
5,輕輕吹打，制成單細(xì)胞懸液，盡量避免氣泡。
6,按照MEF細(xì)胞說明書上建議的復(fù)蘇培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)移至1個T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，加入培養(yǎng)液14 ml。
7,放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
復(fù)蘇第二天觀察，如死細(xì)胞較多，更換新鮮的MEF完全培養(yǎng)液，可以使細(xì)胞生長的更好。
傳代：
1,待細(xì)胞長到90%-100%滿時進(jìn)行傳代，一般3-4天，具體視細(xì)胞生長情況而定。
2,吸除廢液。
3,用PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。
4,加入2.5 ml的0.25%胰酶（含EDTA）至培養(yǎng)瓶，輕輕晃動，使胰酶覆蓋底面，置于37℃5,培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。
6,在顯微鏡下觀察，直至細(xì)胞層全部脫落（一般需要1-2 min）。
7,加2.5 ml MEF完全培養(yǎng)液終止消化。
8,多次輕輕吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。
9,按照1:2-1:3的比例進(jìn)行傳代。
10,放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
凍存：
1,按傳代的方法將細(xì)胞消化下來，制成細(xì)胞懸液。
2,以1000 rpm，離心5 min，棄上清，逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液，懸浮細(xì)胞。
3,按每支凍存管內(nèi)加入500 ml細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi)，標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
4,將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過夜，轉(zhuǎn)入液氮。
凍存液配方：
MEF完全培養(yǎng)液80%，FBS10%，DMSO 10%