一、實(shí)驗(yàn)器材
1．儀器
倒置顯微鏡，CO2培養(yǎng)箱，普通冰箱，超凈工作臺(tái)，低速冷凍離心機(jī)．顯微數(shù)碼攝影系統(tǒng)，孵蛋器。
2．材料與試劑
(1)非無菌材料酒精棉球，離心管架，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板．記號(hào)筆。
(2)無菌材料和試劑 輔料鑷，眼科鑷，眼科手術(shù)剪，一次性培養(yǎng)皿，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，15m1離心管，長(zhǎng)絲滴管，10ml刻度移液管，0．25％胰蛋白酶溶液．含500u／ml硫酸慶大霉素的Hank’s液，10％Bs—DMEM培養(yǎng)液，lmol／L HCl溶液。
(3)組織細(xì)胞材料孵化10d的雞胚蛋。
二、操作步驟
1．消化法培養(yǎng)——原代細(xì)胞培養(yǎng)
(1)取材取孵化lOd的雞胚蛋，75％酒精棉球擦拭蛋殼．大頭朝上平穩(wěn)立放于離心管架上。用輔料鑷剝開頂部的部分蛋殼，換一把眼科鑷挑破血囊膜，小心取出雞胚，放于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用手術(shù)剪除去頭部，然后用彎頭眼科捏夾起腹部皮膚，剪開腹腔和胸前，去除內(nèi)臟。
(2)漂洗和剪切將胚體用鑷子夾取，用含500U／ml硫酸慶大霉素的Hank’s液淋洗3遍以去除血污(含紅細(xì)胞等血液細(xì)胞)，轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用手術(shù)剪剪成lmm3的小塊。
(3)消化加入無菌O．25％胰蛋白酶溶液使組織塊浸沒，放37℃培養(yǎng)箱保溫10～20min，期間每3～5min觀察、振搖1次，使組織松散。若觀察到組織塊顯白色時(shí)，取到超凈工作臺(tái)內(nèi)，無菌操作用長(zhǎng)絲滴管反復(fù)吹打組織塊。添加3～5ml完全培養(yǎng)液，換一支長(zhǎng)絲滴管反復(fù)吹打，將細(xì)胞懸液通過100目不銹鋼篩網(wǎng)，收集到另一個(gè)無菌培養(yǎng)皿內(nèi)·換另一支長(zhǎng)絲滴管，收集細(xì)胞懸液到無菌15ml外螺旋蓋離心管內(nèi)。
(4)離心與計(jì)數(shù)1000r／min 6min離心，無菌操作下小心傾倒去除上清。然后用彈指法使沉淀松散，添加5～10ml完全培養(yǎng)液，用長(zhǎng)絲滴管小心混勻。用微量移液器取細(xì)胞懸液到計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每次2個(gè)計(jì)數(shù)窗的讀數(shù)應(yīng)接近，取平均值為本次讀數(shù)的細(xì)胞密度，連續(xù)2次的讀數(shù)相近時(shí)取均值代表該單細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度。
(5)接種與培養(yǎng) 用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×105／ml，接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，接種2孔。
標(biāo)注組織細(xì)胞名稱、班級(jí)組號(hào)、接種日期等信息。
靜置后，在倒置顯微鏡下觀察孔內(nèi)細(xì)胞狀況和形態(tài)，拍攝數(shù)碼照片。放37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
(6)觀察記錄和換液每天觀察，針對(duì)有代表性的視場(chǎng)，拍攝數(shù)碼照片。記錄內(nèi)容包括：觀察時(shí)間(培養(yǎng)時(shí)間)、細(xì)胞形態(tài)、貼壁情形、染菌狀況、培養(yǎng)液顏色。
在成纖維細(xì)胞形成單層以前．需要每3～4天更換一次新鮮培養(yǎng)液。形成細(xì)胞單層，匯合度接近90％時(shí)即終止培養(yǎng)，整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
2．組織塊培養(yǎng)——組織培養(yǎng)
(1)取材取孵化。lOd的雞胚蛋，75％酒精棉球擦拭蛋殼，大頭朝上平穩(wěn)立放于離心管架上。用輔料鑷剝開頂部的部分蛋殼，換一把眼科鑷挑破血囊膜，小心取出雞胚，放于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用手術(shù)剪除去頭部，然后用彎頭眼科捏夾起腹部皮膚，剪開腹腔和胸前·去瞎內(nèi)臟。
(2)漂洗和剪切 將胚體鑷子夾取，用含500U／ml硫酸慶大霉素的Hank’s液淋洗3童以去除血污(含紅細(xì)胞等血液細(xì)胞)，轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用手術(shù)剪剪成1rrim。的小塊。
(3)離心1000r／min離心6min，無菌操作下小心傾倒去除上清。然后用彈指法使瓶淀松散，添加5～10ml完全培養(yǎng)液，用長(zhǎng)絲滴管小心混勻。離心操作重復(fù)1次。
(4)接種與培養(yǎng)添加新鮮完全培養(yǎng)液．使組織塊浸沒。用長(zhǎng)絲滴管小心取組織塊懸薦液，按3--5mm間隔排布組織塊液滴，置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，接種2孔。小心操作，使每個(gè)小液滴僅含1個(gè)組織塊，可用微量移液器移除多余液體。
標(biāo)注組織細(xì)胞名稱、班級(jí)組號(hào)、接種日期等信息。
針對(duì)有代表性的顯微視場(chǎng)，拍攝數(shù)碼照片。放37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
(5)觀察記錄和換液培養(yǎng)16～24h，每孔添加新鮮完全培養(yǎng)液2．5～3．0ml。逐天觀察培養(yǎng)孔。針對(duì)有代表性的顯微視場(chǎng)，拍攝數(shù)碼照片。記錄內(nèi)容包括：觀察時(shí)間(培養(yǎng)時(shí)間)、細(xì)胞形態(tài)、貼壁情形、染菌狀況、培養(yǎng)液顏色。
在成纖維細(xì)胞形成單層以前，需要每3-4天更換一次新鮮培養(yǎng)液。形成細(xì)胞單層，匯合度接近90％時(shí)即終止培養(yǎng)，整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
三、注意事項(xiàng)
1．自取材開始，保持所有組織細(xì)胞處于無菌條件，細(xì)胞計(jì)數(shù)可在有菌環(huán)境中進(jìn)行。
2．75％酒精泡消毒的時(shí)間不宜過長(zhǎng)，以免酒精從口和肛門浸入雞胚體內(nèi)。
3．待到組織塊周圍長(zhǎng)出單細(xì)胞層后將組織塊剔除，便可收獲細(xì)胞或進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
4．胰蛋白酶消化的時(shí)間長(zhǎng)短與組織細(xì)胞的幼嫩程度、數(shù)量以及酶的活力等因素密切相關(guān)，另外在消化過程中應(yīng)密切觀察，及時(shí)吹打，避免消化過度。
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