一、原理
細菌染色體上整合有前噬菌體（或稱原噬菌體）并能正常生長繁殖而不被裂解的細菌，稱為溶源性細菌。溶源性細菌在自然界中普遍存在，而且自發(fā)裂解，釋放溫和噬菌體，但頻率較低（10-2~105）物理方法（如紫外線和高溫）和化學方法（如絲裂霉素C）可誘導大部分溶源菌裂解并釋放溫和噬菌體。溶源性細菌對同一種或關系密切的噬菌體具有免疫性，因此對于溶源菌的檢查必須有相應的敏感菌株才能確定，敏感菌株對以從待檢的溶源菌株相近的種或變種或不同菌株中找到。
溶源性細菌裂解釋放噬菌體，會給發(fā)酵工業(yè)帶來威脅，溶源性細菌使宿主細胞發(fā)生溶源轉變，不僅可以保護溶源菌免受同源噬菌體的再感染，還會賦予宿主細胞新的特性，溫和噬菌體已被廣泛用于轉導、基因工程載體和分子生物學等領域。本實驗采用誘導方法使溶源細菌裂解.再用敏感菌雙層平板法檢測誘導后噬菌體釋放數(shù)目的增加，從而確認細菌的溶源性。
二、材料
⒈樣品 待檢菌——大腸桿菌225 (λ),敏感菌——大腸桿菌226。
⒉培養(yǎng)基及藥品和試劑 LB固體、半固體和液體培養(yǎng)基，1%蛋白胨，100mmol/l Tris-HCL(pH7.6)緩沖液或生理鹽水，氯仿，0.2%檸檬酸鈉溶液。
⒊設備 水浴箱、臺式離心機、紫外光燈、搖床等。
⒋器皿及其他 試管、培養(yǎng)皿、三角瓶、吸管，離心管、濾膜、濾膜濾菌器等。
三、方法與步驟
本實驗采用紫外線處理誘導溶源菌裂解，未經(jīng)誘導處理的溶源菌菌懸液做對照。
⒈溶源菌培養(yǎng) 將經(jīng)LB斜面活化的大腸桿菌225（λ），接種于裝有20mlLB培養(yǎng)液的250ml三角瓶內，30℃振蕩培養(yǎng)16h，再從中取2ml菌懸液接入另裝有20ml LB培養(yǎng)液的250ml三角瓶內，37℃振蕩培養(yǎng)2h至對數(shù)期。
⒉排除游離噬菌體 如待檢菌株為芽孢桿菌，可先制成孢子懸液，再經(jīng)80℃ 10min處理，殺死溶源菌表面可能吸附的及游離的噬菌體；如待檢菌抹為非芽孢桿菌，可利用噬菌體制備的抗血清或0.2%檸檬酸鈉溶液洗滌對數(shù)期溶源菌細胞，除去表面吸附的及游離的噬菌體。然后經(jīng)4000r/min離心10min，上清液可加人敏感指示菌做雙層平板測定，用于檢驗樣品屮足孖釕游離的噬菌體及吸附「溶源菌表曲的噬菌體，離心后的菌體細胞進行誘導處理。
⒊誘導溶源菌 離心后收集的菌體用無菌生理鹽水洗滌兩次，用生理鹽水或100mmol/l Tris-HCL緩沖液（pH7.0）制成終濃度為1011個/ml細胞的菌懸液，每皿加5ml菌懸液，經(jīng)紫外燈30W，距離30cm、照射30s，立即加入5ml雙倍濃度的LB培養(yǎng)液，混勻后37℃黑暗中培養(yǎng)2h。
⒋溶源性菌株檢查 按雙層瓊脂法操作，取上述誘導裂解液加入幾滴氯仿，以10倍稀釋法適當稀釋，選擇后3個稀釋度的稀釋液，毎個稀釋液取0.3ml與0.2ml對數(shù)期敏感大腸桿菌226菌懸液混勻，再加入融化后冷卻至45℃的LB半體培養(yǎng)基，立即混勻，隨即傾入LB固體培養(yǎng)基平板上，待凝固后，37℃培養(yǎng)6h觀察。經(jīng)過培養(yǎng)的平板如果有大量噬菌斑出現(xiàn)就證明被檢菌株是溶源菌。
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