細(xì)胞破壁：如何制備原生質(zhì)體？
中國微生物菌種查詢網(wǎng) / 2019-05-20 09:21:37
非哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括細(xì)菌、真菌和植物細(xì)胞，都有一個(gè)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)來維持細(xì)胞的形狀。細(xì)胞壁位于細(xì)胞膜外面，特別堅(jiān)固，其特別的組成成分含有聚合物，包圍細(xì)胞內(nèi)部脆弱的細(xì)胞質(zhì)，支撐和保護(hù)細(xì)胞。在細(xì)菌中，細(xì)胞壁包括幾層肽聚糖，真菌細(xì)胞壁含有幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)是昆蟲殼中的化合物組分，植物原生質(zhì)體則被果膠和纖維素包圍。
雖然這些剛性層為保持細(xì)胞形狀提供了重要的功能，但它們在細(xì)胞裂解過程中容易產(chǎn)生問題。為了釋放細(xì)胞內(nèi)容物進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)，需要打破細(xì)胞壁，這是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。這也為遺傳相關(guān)實(shí)驗(yàn)帶來了問題，因?yàn)榧?xì)胞壁是遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移的機(jī)械屏障。
為了避免這些問題，可以部分移除細(xì)胞壁，制造所謂的“裸”細(xì)胞，這些細(xì)胞僅僅被細(xì)胞膜或原生質(zhì)體所包圍。原生質(zhì)體不受完整細(xì)胞壁的限制，呈球形，稱原生質(zhì)球。
原生質(zhì)球
應(yīng)用類型 — 獲得原生質(zhì)體有什么重要作用？
常用方法原生質(zhì)體廣泛用于DNA轉(zhuǎn)化，因?yàn)榧?xì)胞壁會(huì)阻止DNA進(jìn)入細(xì)胞。除了在DNA和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染中使用外，原生質(zhì)體還用于再生整個(gè)植物，原生質(zhì)體融合制備雜交體，膜片鉗實(shí)驗(yàn)等。原生質(zhì)體可用于研究生物膜，包括高分子和病毒的攝取。也用于體細(xì)胞的變異克隆。使用原生質(zhì)體融合技術(shù)可讓原生質(zhì)體也用于植物育種。此外，在某些細(xì)胞中表達(dá)熒光蛋白的植物的原生質(zhì)體可用于熒光活化細(xì)胞分選（FACS），方便保留特定波長發(fā)熒光的細(xì)胞。
原生質(zhì)體
常用方法
去掉植物細(xì)胞壁的方法可以是機(jī)械的人工操作，也可以利用酶解法。較早利用機(jī)械法制備原生質(zhì)體，如將組織切片置于低滲狀態(tài)從而細(xì)胞壁收縮(質(zhì)壁分離)，這種方法產(chǎn)量低，現(xiàn)在很少使用。
酶法更可控、簡單，但需要優(yōu)化，具體的酶取決于具體的細(xì)胞類型:
植物細(xì)胞使用纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶的混合物;
對于較低等的植物細(xì)胞，如海藻，酶的使用將取決于細(xì)胞壁組成；
真菌細(xì)胞從酵母開始，使用幾丁質(zhì)酶；
細(xì)菌細(xì)胞使用溶菌酶+ EDTA。
注意事項(xiàng) - Tips
1.確保具備足夠的初始材料，可以使用相同的試劑多次嘗試，因?yàn)榭赡苄枰{(diào)整條件。這對于利用酶法制備原生質(zhì)球尤為重要。
2.為了得到活的原生質(zhì)體，起始物質(zhì)應(yīng)該處于生命的全盛時(shí)期。所以選擇從幼嫩的植物組織開始，或者在生長的對數(shù)階段積極地進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。非常年輕的組織通常很小，他們更容易受到傷害，這增加了他們在處理中可能無法存活的幾率。另一方面，老的組織不容易再生，更容易感染。
3.在進(jìn)行任何處理前將細(xì)胞冷卻并保持是很重要的，保持細(xì)胞低溫可以減緩壞死。但保持細(xì)胞溫度高于冰點(diǎn)也是至關(guān)重要的，因?yàn)榧词故窃诮橘|(zhì)中短暫形成的冰晶也會(huì)損害細(xì)胞，減少產(chǎn)量。
4.原生質(zhì)球?qū)C(jī)械壓力和滲透壓非常敏感。為了防止它們破裂，需要維持等滲條件，這意味著細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓應(yīng)該相等，滲透壓取決于鹽離子的濃度，不平等的壓力會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破裂(低滲溶液)或內(nèi)爆(高滲溶液)。
5.即使是細(xì)胞的年齡和酶的批次之間的細(xì)微差別，也會(huì)形成不完全的細(xì)胞壁消化和過度消化之間的對比，前者原生質(zhì)球產(chǎn)量為50%，后者導(dǎo)致大量死亡細(xì)胞。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，不需要完全移除細(xì)胞壁——部分移除細(xì)胞壁的原生質(zhì)球就可以了。