菌種的液氮超低溫保藏法！
小吳 / 2019-05-10 14:52:19
1．準(zhǔn)備安瓿管
用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受溫度突然變化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75mm×10mm或能容1.2mL液體的安瓿管。
2．加保護(hù)劑與滅菌
保存細(xì)菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細(xì)胞時(shí)，將空安瓿管塞上棉塞，0.100MPa、121℃滅菌15min。若作保存霉菌菌絲體用，則需在安瓿管內(nèi)預(yù)先加入保護(hù)劑如10%的甘油蒸餾水溶液或10%二甲基亞砜蒸餾水溶液，加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限，而后再用0.100MPa、121℃滅菌15min。
3．制備菌懸液
(1)從生長斜面制備菌懸液每一斜面加入5mL含10%甘油的營養(yǎng)液體培養(yǎng)；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液。
(2)從浸沒培養(yǎng)物制備菌懸液 在浸沒培養(yǎng)液中加入等體積20%無菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散。
4．接入菌種
將0.5～1mL菌懸液分裝已滅菌的玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口。霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內(nèi)切取菌落圓塊，放入含有保護(hù)劑的安瓿管內(nèi)，然后熔封。浸入水中檢查有無漏洞。將所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)基之間達(dá)到平衡。
5．控速冷凍
(1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器中。
(2)將此金屬容器置于控速冷凍機(jī)的冷凍室中。
(3)以1～2℃/min的致冷速度降溫，直到溫度達(dá)到相對溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn)（通常為-30℃）；若細(xì)胞急劇冷凍，則在細(xì)胞內(nèi)會形成冰晶，因而降低存活率。
(4)補(bǔ)加一定量的液氮至系統(tǒng)中，使細(xì)胞在凍結(jié)點(diǎn)時(shí)盡可能快地發(fā)生相變。
如果無控速冷凍機(jī)，則一般可將安瓿或液氮瓶置于-70℃冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。
6．保藏
細(xì)胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1℃/min，直到溫度達(dá)-50℃；將安瓿迅速移入液氮罐中保存，液氮保藏罐內(nèi)的氣相為-150℃，液相為-196℃。
7．恢復(fù)培養(yǎng)
保藏的菌種需要用時(shí)，將安瓿管取出，立即放入38～40℃的水浴中進(jìn)行急劇解凍，輕輕搖動(dòng)以加速熔解，直到全部熔化為止。再打開安瓿管，用巴氏吸管將安瓿中儲存培養(yǎng)物移接入含有2mL無菌液體培養(yǎng)基的試管中，用同一支吸管反復(fù)抽吸數(shù)次，然后取0.1～0.2mL轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上培養(yǎng)。
注意事項(xiàng)如下：
(1)在保藏過程中，如溫度上升，冰晶狀態(tài)發(fā)生變化，就容易導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，因此要經(jīng)常注意液氮的殘存量，定期補(bǔ)充。
(2)冷凍保藏菌種熔化使用后不應(yīng)再次冷凍保存，反復(fù)冷凍、熔化，菌種生存率將顯著下降。
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