大腸桿菌的對(duì)照培養(yǎng)分離及菌種保存方法
中國(guó)微生物菌種查詢網(wǎng) / 2019-05-07 14:24:23
大腸桿菌(Escherichia coli)是分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)、基因工程操作中廣泛采用的一種受體菌，是Escherich在1885年發(fā)現(xiàn)的，在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)，一直被當(dāng)作正常腸道菌群的組成部分，認(rèn)為是非致病菌。直到20世紀(jì)中葉，才認(rèn)識(shí)到一些特殊血清型的大腸桿菌對(duì)人和動(dòng)物有病原性，尤其對(duì)嬰兒和幼畜（禽），常引起嚴(yán)重腹瀉和敗血癥，它是一種普通的原核生物，根據(jù)不同的生物學(xué)特性將致病性大腸桿菌分為5類：致病性大腸桿菌(EPEC)、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)、腸黏附性大腸桿菌(EAEC)。大腸桿菌屬于細(xì)菌。它的遺傳背景研究的比較詳細(xì)，常用做寄主進(jìn)行基因擴(kuò)增及外源基因的表達(dá)。
一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?:
掌握大腸桿菌的對(duì)照培養(yǎng)、單菌落的分離及菌種保存方法。
二. 實(shí)驗(yàn)原理 :
大腸桿菌除本身的核染色體外，往往還含有質(zhì)粒(Plasmid)DNA，這是一種雙鏈閉合環(huán)狀的DNA分子，大小在1Kb-200Kb左右，通常質(zhì)粒DNA帶有利于細(xì)菌在某一特定環(huán)境下生存的酶的基因，而使寄主菌表現(xiàn)以下一些表現(xiàn)型:
1．對(duì)抗生素的抗性 2．產(chǎn)生抗生素 3．降解有機(jī)復(fù)合物
4．產(chǎn)生大腸桿菌素 5．產(chǎn)生內(nèi)毒素 6．產(chǎn)生限制修飾酶
pUC19質(zhì)粒上帶有一個(gè)與大腸桿菌抗氨芐青霉素(Ampecillin)有關(guān)的基因，它能編碼一種β-內(nèi)酰胺酶，這種酶降解氨芐青霉素，從而消除了抗生素對(duì)細(xì)胞壁形成的抑制作用，不含這種質(zhì)粒的細(xì)菌則不能在含抗生素的培養(yǎng)基上存活。
三．實(shí)驗(yàn)材料 : E．coli InvaF' E．coli InvaF' (pUC19)
四．實(shí)驗(yàn)儀器 、器皿及試劑:儀器 : 超凈工作臺(tái) 恒溫培養(yǎng)箱 高壓滅菌鍋 恒溫水浴鍋 微波爐等。器皿: (見附錄)
試劑 : 瓊脂 酵母抽提物 胰蛋白胨 Nacl 氨芐青霉素 NaOH等
五．實(shí)驗(yàn)步驟 :
1. 配制培養(yǎng)基：
ａ．LB(Lurib-Bertani) media
酵母抽提物 (Yeast extract) 5g/L
胰蛋白胨 (trytone) 10g/L
Nacl 10g/L
加蒸餾 水定容至1000ml調(diào)節(jié)pH值至7.0。配制750ml固體培養(yǎng)基: 在上述液體培養(yǎng)基中，按15 g/L加入瓊脂 加熱至充分熔化，即成固體培養(yǎng)基。ｂ：50%的丙三醇: 取50ml丙三醇加入50mlddH2 O至100ml。將上述培養(yǎng)基和丙三醇溶液高溫蒸汽消毒15磅20min
2.倒平板:將固體培養(yǎng)基加熱至充分熔化，待溫度降至50℃以下凝固前，加入Amp至100ug/ml搖動(dòng)混勻，每平皿倒入25ml左右，此過程應(yīng)進(jìn)行無菌操作，另倒一不含Amp的LB平板。3. 待培養(yǎng)基凝固以后，用接種環(huán)(灼燒消毒后)分別接種各一環(huán)貯存菌種 :E.coli InvaF' 和 E.coli InvaF' (pUC19)于不含Amp的LB平板上和含Amp的LB平板上,劃線接種要防止劃破培養(yǎng)基，劃線方法如圖所示:
培養(yǎng)基
第一次劃線后接種環(huán)灼燒 第二次劃線起點(diǎn)與第一次 如此在平板上
再進(jìn)行第二次劃線 劃線交*，接種環(huán)灼燒后再
進(jìn)行第三次劃線
4.接種完成后將培養(yǎng)皿倒置入培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)過夜，運(yùn)用這種劃線方法接種，可以較好地保證單菌落的形成。
5.比較兩菌系在培養(yǎng)基上的不同反應(yīng)。挑取:E.coli InvaF' E.coli InvaF' (pUC19)的單菌落分別接種至含Amp和不含Amp的5ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
6.分別吸取0．5 ml菌液在無菌條件下，加入0．5 ml 50%丙三醇，置一滅菌的凍干管中，混勻至-20℃保存。