如何提高彎曲芽孢桿菌的熱穩(wěn)定性？
野生型和突變體D476N分別純化后，酶學(xué)性質(zhì)測定表明：突變體D476N的最適pH為6.5，與野生型相比降低了0.5。突變體D476N和野生型的最適溫度均為55 ℃，突變體D476N在55 ℃下的半衰期為35 min，比野生型提高了95%。突變體D476N的T50值比野生型提高4 ℃。
突變體D476N的Km值為97.98 μmol/L，是野生型(85.86 μmol/L) 1.14倍；突變體穩(wěn)定性提高的同時，催化活力相對于野生型有略微下降。通過SWISS-MODEL同源模擬野生型和突變體D476N的三維結(jié)構(gòu)，并通過PyMol軟件分析，發(fā)現(xiàn)突變后的氨基酸殘基Asn476位于蛋白質(zhì)表面的loop環(huán)上，通過MOE軟件計算，D476N的分子自由能(ΔG)為106.01 kcal/mol，比野生酶降低10.3%，這一結(jié)果與蛋白質(zhì)分子自由能和熱穩(wěn)定性呈負相關(guān)的理論相符。
β-淀粉酶(β-amylase，EC 3.2.1.2)，又稱淀粉β-1, 4-麥芽糖苷酶，是一種外切型淀粉酶，能夠從淀粉的非還原末端依次水解相隔的α-1, 4-葡萄糖苷鍵生成麥芽糖。在大麥、甘薯、玉米、小麥和大豆等高等植物中都有著較豐富的β-淀粉酶，其在釀造行業(yè)及食品工業(yè)中有很大的應(yīng)用價值。
例如，啤酒釀造行業(yè)利用麥芽中的β-淀粉酶直接糖化，白酒工業(yè)中用作糖化劑；在食品工業(yè)中主要用于生產(chǎn)高麥芽糖漿、麥芽糖醇和飴糖等。自1974年Higashihara等首次發(fā)現(xiàn)了巨大芽孢桿菌 Bacillus megaterium 胞外含有β-淀粉酶以來，又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其他幾種能產(chǎn)生該酶的微生物，包括蠟狀芽孢桿菌 Bacillus cereus 、環(huán)狀芽孢桿菌 Bacillus circulans 、多粘芽孢桿菌 Bacillus polymyxa 、熱厭氧桿菌屬 Thermoanaerobacterium 和高溫放線菌 Thermeoactinomyces sp.等。
由于植物來源的β-淀粉酶提取、純化過程較為復(fù)雜，成本較貴，相比而言微生物來源的β-淀粉酶具有生產(chǎn)操作簡單、適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點。但是現(xiàn)已報道的微生物來源的β-淀粉酶大多耐熱性差，且比酶活不高，不利于其工業(yè)化應(yīng)用。因此篩選出高熱穩(wěn)定性的微生物β-淀粉酶對其在淀粉糖工業(yè)中的應(yīng)用有著十分重要的意義。
易錯PCR屬于蛋白質(zhì)的非理性設(shè)計，不需要事先了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化機制、保守序列等因素，而是通過模擬自然進化機制來為酶基因創(chuàng)造體外進化的條件，進而對目的蛋白進行分子改造，并定向篩選研究進化酶的酶學(xué)性質(zhì)。易錯PCR技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的定向進化方法之一，具有操作方便、快速、高效的優(yōu)點。
目前國內(nèi)外多數(shù)專家學(xué)者使用體外分子進化技術(shù)研究了多種酶制劑，諸如脂肪酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶等，其酶學(xué)性質(zhì)都得到了一定的改善。對于微生物來源β-淀粉酶的研究，目前主要是圍繞不同宿主的克隆表達、酶學(xué)定性，而針對其酶學(xué)性質(zhì)的分子改造顯得較少，在定向進化提高其熱穩(wěn)定性方面，尚未見相關(guān)文獻報道。
β-淀粉酶作為一種重要的工業(yè)用酶，廣泛應(yīng)用于淀粉糖、食品及醫(yī)藥等生產(chǎn)領(lǐng)域。例如，與麥芽糖淀粉酶、普魯蘭酶等復(fù)配制備超高純度麥芽糖漿，生產(chǎn)高附加值的海藻糖、麥芽酮糖等。然而其熱穩(wěn)定性差，不利于酶的復(fù)配轉(zhuǎn)化，具有容易染菌、反應(yīng)液粘度高等缺點。本研究通過易錯PCR技術(shù)對比酶活較高的彎曲芽孢桿菌來源的β-淀粉酶進行體外分子定向進化，通過LB瓊脂淀粉板初篩、96孔板DNS法測酶活等方法，高通量篩選熱穩(wěn)定性提高的突變體，以期為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。