1 真菌的保藏方法及優(yōu)缺點分析
目前有很多保藏方法可以適用于真菌的保藏，但大體來可以分為三類：一是讓真菌連續(xù)生長的保藏工藝。這一類的保藏工藝的特點是不斷的將菌株移植在新鮮的培養(yǎng)基上，并在合適的條件下生長，隨后置于一個低溫的環(huán)境中，一般是4-10℃，這類保藏工藝主要包括斜面移植、油管保藏和蒸餾水保藏法等。二是利用干燥環(huán)境保藏菌株的休眠體，如分生孢子、厚垣孢子等，干燥選用的基質(zhì)可以是空氣、硅膠、土壤、沙子等。三是利用抑制菌株代謝活性的辦法達到長期保藏，一般是通過脫水降低細胞內(nèi)水分或低溫冷凍，在此過程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)是避免和降低冰晶對細胞造成的傷害，這類保藏工藝包括冷凍干燥法、低溫凍結(jié)和液氮保藏法等。Ryan和Smith對各種保藏方法進行了優(yōu)劣比較。
大多數(shù)真菌資源研究利用基本上是以得到純的培養(yǎng)物為前提，而真菌在培養(yǎng)的過程中，必然離開原來的生長環(huán)境，營養(yǎng)、環(huán)境條件發(fā)生改變，這是真菌發(fā)生性狀改變的重要因子，真菌培養(yǎng)物長期保藏就會不可避免的發(fā)生性狀變化。難以培養(yǎng)的真菌以及一些專性寄生真菌不能在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長，其主要原因是在目前認知條件下，不能夠提供此類微生物生長所需的必要條件。此外，絲狀真菌保藏一般采用保藏真菌的孢子、菌絲，其中保藏真菌的孢子一般周期較長，活性較為穩(wěn)定，但無論在無性階段產(chǎn)生分生孢子還是有性階段產(chǎn)生的性孢子，都是經(jīng)過基因重組階段，這就增加了保藏菌株發(fā)生變異的可能性。真菌在分離、培養(yǎng)、保藏的工藝處理、長期保藏、保藏后復(fù)活等環(huán)節(jié)上，都有可能造成真菌細胞發(fā)生損壞或基因組信息缺失，從而引起性狀發(fā)生變化。
2 長期保藏對真菌培養(yǎng)特征的影響
對于用于分類研究的模式菌、教學研究、專利菌株保藏以及作為環(huán)境參考菌株來說，保持真菌培養(yǎng)特征的穩(wěn)定性是非常必要的。低溫保藏一般認為可以降低真菌的代謝速率，但Tian和Bertolini報道了Botrytis allii 和 Penicillium hirsutum 在低溫保藏下孢子萌發(fā)時間提前和萌發(fā)管延伸速度加快。Wing等發(fā)現(xiàn)Fusarium compactum 和 Fusarium acuminatum菌株經(jīng)過連續(xù)10次的單孢和菌絲生長尖端分離后，菌株發(fā)生退化。Kim觀察到了Fusarium oxysporumf.sp.niveeum 菌株經(jīng)過保藏后菌絲變細、變薄，經(jīng)過18次的連續(xù)傳代培養(yǎng)后，發(fā)生“角變”，菌落形態(tài)發(fā)生變化以及不再產(chǎn)生色素，且“角變”的性狀在以后的傳代培養(yǎng)中保持不變。Pholiota nameko 菌株長期保藏后用于接種生產(chǎn)后，產(chǎn)量下降，其原因是子實體形成滯后和數(shù)量下降，菌絲的生長速度和漆酶的活性發(fā)生變化。目前雖然很少有文獻報道真菌在長期保藏過程中引起的孢子大小、產(chǎn)孢特征等性狀的變異情況，而產(chǎn)孢能力下降，活性降低報道較多。Aparecido等對一些植物病原真菌長期保藏后的活性、致病力、孢子萌發(fā)等指標進行了監(jiān)測[8]。Maria等[9]在比較蒸餾水和礦油保藏三年的保藏結(jié)果中，二株Aureobasidium pullulans 和一株Thamnidium elegans礦油保藏沒有檢測到活性，而蒸餾水保藏方法中Absidia glauca Alternari dianthicola Colletothrichum coccodes Fusarium fusarioides Gliocladium roseum等5個菌株沒有檢測到活性，同時發(fā)現(xiàn)保藏于礦油中的Aspergillus flavescens Colletotrichum coffeanum Fusarium culmorum Fusarium oxysporum Giliocladium roseum Verticillium lecanii各一個菌株喪失了產(chǎn)孢特性。
3 長期保藏對真菌生理生化性狀的影響
對于一些病原菌來說，真菌長期保藏過程中如何避免致病力的喪失成為最大的難題，真菌長期保藏過中，致病力下降的報道較多。Kelly 等發(fā)現(xiàn)Fusarium oxysporum f.sp. ciceris經(jīng)過六年的在PDA培養(yǎng)基上大量的轉(zhuǎn)接后在接種到鷹嘴豆上沒有致病力。一些保藏在蒸餾水中的Phytothphora 菌株經(jīng)過長期保藏后也喪失了致病性。Ryan 和 Ellison 用原位結(jié)合超低溫保藏的技術(shù)方法對Puccinia spegazzinii菌株進行了保藏處理，經(jīng)過保藏后的菌株依然有產(chǎn)生擔孢子的能力，但對寄主侵染能力下降，在葉柄的侵染沒有成功。一些昆蟲和植物的病原菌如果不經(jīng)過回接到寄主昆蟲或植物，也會逐漸喪失其致病性。Mota等驗證了Arthrobotrys robusta和 Monacrosporium thaumasium菌株結(jié)合線蟲的不同保藏工藝處理對捕食線蟲能力的影響，發(fā)現(xiàn)添加保護劑可以提高Arthrobotrys robusta和Monacrosporium thaumasium菌株防治線蟲的能力。López Lastra等對一些Hyphomycetes Entomophthorales Trichomycetes和 Oomycetes的9株內(nèi)生病原真菌進行了18個月的長期保藏的試驗，并在第3、6、12、18個月分別監(jiān)測保藏菌株的活性及其侵染性，Paecilomyces fumosoroseus菌株蒸餾水、礦油、-20℃和-80℃保藏等幾種保藏方法都適合，Smittium culisetae 和 Leptolegnia chapmanii 菌株只適合于蒸餾水和礦油保藏。Tommerup用凍干法保藏VA真菌，并監(jiān)測了其孢子萌發(fā)能力、菌絲生長能力以及定殖能力。對于一些菌株的致病性等能力的喪失，可以用一些酶活和代謝產(chǎn)物的指標進行監(jiān)測。Shinohara 等發(fā)現(xiàn)，用于釀酒的Saccharomyces cerevisiae 菌株經(jīng)過多次的斜面轉(zhuǎn)接后，引起了酒品質(zhì)的變化。
真菌次級代謝產(chǎn)物一直是真菌學研究利用的重點，真菌可以產(chǎn)生一系列的次級代謝產(chǎn)物， 并且一些典型的代謝產(chǎn)物可以用于真菌類群的劃分。Svendsen 和 Frisvad報道次級代謝產(chǎn)物chemosystematics應(yīng)用聚類分析分析279株青霉真菌到種的水平上。對于真菌次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)菌株來說，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物功能的穩(wěn)定性保藏及其重要，但是真菌在保藏及其生產(chǎn)等過程中可能喪失產(chǎn)生某一種代謝產(chǎn)物的能力。Svendsen 和 Frisvad發(fā)現(xiàn)兩株P(guān)enicillium comembertii 喪失了產(chǎn)橘霉素的能力（citrinin），這兩株菌Bridge 等報道能夠產(chǎn)生橘霉素。真菌菌株發(fā)生退化可能是真菌產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的情況發(fā)生了改變。Ryan在對Metarhizium anisopliade 和Fusarium oxysporum 菌株進行保藏處理后發(fā)現(xiàn)次級代謝的產(chǎn)生情況發(fā)生了改變[20]，菌株產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的能力對保藏過程極為敏感，多數(shù)的保藏物與保藏前的次級代謝產(chǎn)物情況發(fā)生了改變，產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性隨著保藏時間的延長而降低。經(jīng)過兩年的保藏，斜面轉(zhuǎn)接保藏方法保藏的菌株M. anisopliade 和 F. oxysporum都喪失了產(chǎn)生胞外次級代謝物的特點，而用其它保藏方法的一部分菌株產(chǎn)生某些次級代謝產(chǎn)物的特點得以保存。在Ryan研究中還發(fā)現(xiàn)，真菌的保藏方法對于菌株的次級代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性保藏局限于“株”的水平上，對于同一種的不同菌株來說，同一保藏方法處理，得到的保藏結(jié)果可能就不一樣。真菌的次級代謝產(chǎn)物可以應(yīng)用于分類學、教學研究以及應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，長期保藏過程中菌株次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生情況發(fā)生改變，帶來的后果將是十分嚴重。
真菌有產(chǎn)生多種胞外酶利用多種類型底物的能力，真菌酶作用機理、酶制劑的研究開發(fā)歷來受到重視，一些誘導(dǎo)酶，如脂肪酶、幾丁質(zhì)酶、蛋白酶等具有降解復(fù)雜大分子結(jié)構(gòu)物質(zhì)的能力，在昆蟲、植物病害的生物防治中具有重要作用?；盍φ婢L期保藏對酶活力變化的影響長期存在。一些商業(yè)開發(fā)的檢測板，如APTZYM、API50CH以及Biolog檢測板可以用于分析真菌胞外酶活的變化情況。Ryan在研究M. anisopliade 和 F.oxysporum發(fā)現(xiàn)，其胞外酶的分泌能力在長期保藏過程中發(fā)生改變，而酶活力是菌株生理穩(wěn)定性重要指標，不同保藏方法對酶活力的穩(wěn)定性同樣體現(xiàn)在“株”的水平上，而不是“種”的水平[16]。Ryan在F. oxysporum菌株兩年的保藏試驗中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的分離物喪失了α-甘露糖苷酶或β-木聚糖酶活性，殼二糖酶、葡聚糖酶和阿拉伯糖酶活性偶爾喪失。M. anisopliade在兩年的低溫保藏試驗中，喪失了β-galacosidase α-fucosidase β-chitobiosidase β-glucuronidase的活性。M. anisopliadeM1菌株的leucine arylamidasde的活性在所有經(jīng)過蒸餾水保藏的分離物中能夠檢測到，而在凍干和低溫保藏的分離物中部分能夠檢測到leucine arylamidasde的酶活。而對于tryspin的酶活檢測，在-20℃的低溫保藏處理和蒸餾水的保藏tryspin的酶活力情況保藏最好。
分子生物學在近20年的時間里發(fā)展較快，基于PCR技術(shù)使真菌長期保藏后的基因信息完整性檢測成為可能，如果真菌在保藏過程中基因信息發(fā)生缺失的話，那就有可能真菌的一些有價值的生理性狀、產(chǎn)酶能力遭到破壞。對于模式菌保藏過程中基因信息的缺失，在分子信息的分類研究中，完全有可能影響分類學的研究結(jié)果。Kumata等注意到來自不同菌種保藏中心的同一個Trichoderma菌株，在PCR分子指紋分析中，得出了相偏離的結(jié)果。Kelly 等在對保藏了12年的F. oxysporum f.sp. ciceris菌株的一個分離物與其它分離物相比，沒有顯現(xiàn)出應(yīng)有的典型分子特征。Horgen結(jié)合RFLP與染色體分析，研究了Agaricus bisporus 菌株染色體丟失、退化情況。Shinohara 等發(fā)現(xiàn)Saccharomyces cerevisiae 在450天內(nèi)經(jīng)過150次的轉(zhuǎn)接，菌株的染色體核型發(fā)生了微小的變化。F. oxysporumf.sp.niveeum 菌株在連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)DNA的甲基化現(xiàn)象。斜面轉(zhuǎn)接、油管等保藏方法的機理是降低菌株的代謝速率，而凍干、超低溫保藏的機理是停止細胞代謝，目前對細胞代謝停止、恢復(fù)代謝后真菌基因信息、染色體信息是否完整的研究報道較少。