實驗人員如何在免疫熒光染色少走彎路？
中國微生物菌種查詢網(wǎng) / 2019-04-10 09:22:19
操作方案要優(yōu)化
免疫熒光染色的操作方案通常包括：固定和透化、封閉、一抗孵育、洗滌、二抗孵育、再次洗滌以及測定讀數(shù)。行業(yè)人員解釋說：“大多數(shù)研究人員的染色方案都是一成不變的，因此我們建議在使用珍貴的樣本材料時，花點時間優(yōu)化操作方案的每一步。”“就一抗孵育而言，你必須考慮抗體的建議稀釋度，以實現(xiàn)高的信背比。若抗體濃度過低，則熒光信號較弱，可能難以與背景區(qū)分開，但抗體濃度過高，則會導(dǎo)致較高的背景染色。”
此外，千萬不要低估各步驟之間徹底洗滌的重要性?！袄蒙砣芤簛硐礈?，可去除未結(jié)合的熒光試劑，或那些只是粘在目標上而非特異性結(jié)合的熒光試劑，從而提高信背比。”
熒光試劑要放好
盡管許多熒光基團具有相對的光穩(wěn)定性，但在保存和染色過程中若未能避光，則可能導(dǎo)致熒光基團-抗體結(jié)合物降解，引起假陰性結(jié)果。熒光物質(zhì)必須在建議溫度下小心保存，并始終注意避光，以保護其光譜完整性。他特別指出，串聯(lián)的熒光基團對頻繁操作引起的不穩(wěn)定性特別敏感?！氨M管免疫熒光技術(shù)提供了準確的結(jié)果，但也存在一些缺點，包括自發(fā)熒光、熒光信號的淬滅，以及標本存儲過程中的信號褪色。按照建議的實驗方案來操作，研究人員可以避免一些技術(shù)上的缺陷?！?br />
選擇熒光要謹慎
免疫熒光技術(shù)的一個主要優(yōu)勢在于它為多重檢測提供了機會，如今流式細胞儀能檢測每個細胞中20多個離散參數(shù)。在設(shè)計多重實驗時，應(yīng)考慮每種熒光基團的獨特性質(zhì)，如最大吸收波長和最大發(fā)射波長，消光系數(shù)和斯托克斯位移等因素。Moh“人們通常要檢測組織或細胞樣本中的多個抗原，必須選擇光譜不重疊的熒光基團。即使是最好的檢測系統(tǒng)，也無法克服儀器和試劑之間的不匹配?！?br />
合適對照不可少
任何實驗數(shù)據(jù)的分析都依賴于相關(guān)的對照，免疫熒光染色也不例外。不加一抗，則能說明觀察到的信號是否來源于二抗與組織或細胞樣本的非特異性結(jié)合，“此外，我們建議使用不表達目標的細胞或組織作為陰性對照。同時，為了確保所有組分都正常發(fā)揮作用，那些已知表達目標的陽性對照也少不了。在熒光Western blot或ELISA技術(shù)中，含有目標抗原的蛋白或肽段適合作為陽性對照?！?br />
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