真菌資源的研究利用多以培養(yǎng)物方式保藏，在多數情況下，真菌資源保藏者一般只監(jiān)測菌株的活性指標，而真菌形態(tài)特征、菌株酶活、致病力、產生次級代謝物的能力等菌株功能特征是否穩(wěn)定卻由于技術、工作量等原因往往被忽略。真菌的長期保藏要保證菌株的生理性狀和遺傳信息的完整性 。本文通過簡述真菌長期保藏過程中一些菌株的形態(tài)、生理生化性狀的變化，旨在引起對真菌長期保藏與監(jiān)測的重視。
1 真菌的保藏方法及優(yōu)缺點分析
目前有很多保藏方法可以適用于真菌的保藏，但大體來可以分為三類：一是讓真菌連續(xù)生長的保藏工藝 。這一類的保藏工藝的特點是不斷的將菌株移植在新鮮的培養(yǎng)基上，并在合適的條件下生長，隨后置于一個低溫的環(huán)境中，一般是4-10℃，這類保藏工藝主要包括斜面移植、油管保藏和蒸餾水保藏法等。二是利用干燥環(huán)境保藏菌株的休眠體，如分生孢子、厚垣孢子等，干燥選用的基質可以是空氣、硅膠、土壤、沙子等。三是利用抑制菌株代謝活性的辦法達到長期保藏，一般是通過脫水降低細胞內水分或低溫冷凍，在此過程中關鍵環(huán)節(jié)是避免和降低冰晶對細胞造成的傷害，這類保藏工藝包括冷凍干燥法、低溫凍結和液氮保藏法等。Ryan和Smith對各種保藏方法進行了優(yōu)劣比較 。
大多數真菌資源研究利用基本上是以得到純的培養(yǎng)物為前提，而真菌在培養(yǎng)的過程中，必然離開原來的生長環(huán)境，營養(yǎng)、環(huán)境條件發(fā)生改變，這是真菌發(fā)生性狀改變的重要因子，真菌培養(yǎng)物長期保藏就會不可避免的發(fā)生性狀變化。難以培養(yǎng)的真菌以及一些專性寄生真菌不能在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長，其主要原因是在目前認知條件下，不能夠提供此類微生物生長所需的必要條件。此外，絲狀真菌保藏一般采用保藏真菌的孢子、菌絲，其中保藏真菌的孢子一般周期較長，活性較為穩(wěn)定，但無論在無性階段產生分生孢子還是有性階段產生的性孢子，都是經過基因重組階段，這就增加了保藏菌株發(fā)生變異的可能性 。真菌在分離、培養(yǎng)、保藏的工藝處理、長期保藏、保藏后復活等環(huán)節(jié)上，都有可能造成真菌細胞發(fā)生損壞或基因組信息缺失，從而引起性狀發(fā)生變化。
2 長期保藏對真菌培養(yǎng)特征的影響
對于用于分類研究的模式菌、教學研究、專利菌株保藏以及作為環(huán)境參考菌株來說，保持真菌培養(yǎng)特征的穩(wěn)定性是非常必要的。低溫保藏一般認為可以降低真菌的代謝速率，但Tian和Bertolini報道了Botrytis allii 和 Penicillium hirsutum 在低溫保藏下孢子萌發(fā)時間提前和萌發(fā)管延伸速度加快 。Wing等發(fā)現(xiàn)Fusarium compactum 和 Fusarium acuminatum菌株經過連續(xù)10次的單孢和菌絲生長尖端分離后，菌株發(fā)生退化 。Kim觀察到了Fusarium oxysporum f.sp.niveeum 菌株經過保藏后菌絲變細、變薄，經過18次的連續(xù)傳代培養(yǎng)后，發(fā)生“角變”，菌落形態(tài)發(fā)生變化以及不再產生色素，且“角變”的性狀在以后的傳代培養(yǎng)中保持不變 。Pholiota nameko 菌株長期保藏后用于接種生產后，產量下降，其原因是子實體形成滯后和數量下降，菌絲的生長速度和漆酶的活性發(fā)生變化。目前雖然很少有文獻報道真菌在長期保藏過程中引起的孢子大小、產孢特征等性狀的變異情況，而產孢能力下降，活性降低報道較多。Aparecido等對一些植物病原真菌長期保藏后的活性、致病力、孢子萌發(fā)等指標進行了監(jiān)測 。Maria等 在比較蒸餾水和礦油保藏三年的保藏結果中，二株Aureobasidium pullulans 和一株Thamnidium elegans礦油保藏沒有檢測到活性，而蒸餾水保藏方法中Absidia glauca Alternari dianthicola Colletothrichum coccodes Fusarium fusarioides Gliocladium roseum等5個菌株沒有檢測到活性，同時發(fā)現(xiàn)保藏于礦油中的Aspergillus flavescens Colletotrichum coffeanum Fusarium culmorum Fusarium oxysporum Giliocladium roseum Verticillium lecanii各一個菌株喪失了產孢特性。
3 長期保藏對真菌生理生化性狀的影響
對于一些病原菌來說，真菌長期保藏過程中如何避免致病力的喪失成為最大的難題，真菌長期保藏過中，致病力下降的報道較多。Kelly 等發(fā)現(xiàn)Fusarium oxysporum f.sp. ciceris經過六年的在PDA培養(yǎng)基上大量的轉接后在接種到鷹嘴豆上沒有致病力 。一些保藏在蒸餾水中的Phytothphora 菌株經過長期保藏后也喪失了致病性[11]。Ryan 和 Ellison 用原位結合超低溫保藏的技術方法對Puccinia spegazzinii菌株進行了保藏處理，經過保藏后的菌株依然有產生擔孢子的能力，但對寄主侵染能力下降，在葉柄的侵染沒有成功。一些昆蟲和植物的病原菌如果不經過回接到寄主昆蟲或植物，也會逐漸喪失其致病性。Mota等 驗證了Arthrobotrys robusta和 Monacrosporium thaumasium菌株結合線蟲的不同保藏工藝處理對捕食線蟲能力的影響，發(fā)現(xiàn)添加保護劑可以提高Arthrobotrys robusta和 Monacrosporium thaumasium菌株防治線蟲的能力。López Lastra等 對一些Hyphomycetes Entomophthorales Trichomycetes和 Oomycetes的9株內生病原真菌進行了18個月的長期保藏的試驗，并在第3、6、12、18個月分別監(jiān)測保藏菌株的活性及其侵染性，Paecilomyces fumosoroseus菌株蒸餾水、礦油、-20℃和-80℃保藏等幾種保藏方法都適合，Smittium culisetae 和 Leptolegnia chapmanii 菌株只適合于蒸餾水和礦油保藏。Tommerup用凍干法保藏VA真菌，并監(jiān)測了其孢子萌發(fā)能力、菌絲生長能力以及定殖能力 。對于一些菌株的致病性等能力的喪失，可以用一些酶活和代謝產物的指標進行監(jiān)測。Shinohara 等 發(fā)現(xiàn)，用于釀酒的Saccharomyces cerevisiae 菌株經過多次的斜面轉接后，引起了酒品質的變化。
真菌次級代謝產物一直是真菌學研究利用的重點，真菌可以產生一系列的次級代謝產物 ， 并且一些典型的代謝產物可以用于真菌類群的劃分 。Svendsen 和 Frisvad報道次級代謝產物chemosystematics應用聚類分析分析279株青霉真菌到種的水平上 。對于真菌次級代謝產物的生產菌株來說，產生代謝產物功能的穩(wěn)定性保藏及其重要，但是真菌在保藏及其生產等過程中可能喪失產生某一種代謝產物的能力。Svendsen 和 Frisvad發(fā)現(xiàn)兩株Penicillium comembertii 喪失了產橘霉素的能力（citrinin） ，這兩株菌Bridge 等報道能夠產生橘霉素 。真菌菌株發(fā)生退化可能是真菌產生次級代謝產物的情況發(fā)生了改變 。Ryan在對metarhizium anisopliade 和 Fusarium oxysporum 菌株進行保藏處理后發(fā)現(xiàn)次級代謝的產生情況發(fā)生了改變 ，菌株產生次級代謝產物的能力對保藏過程極為敏感，多數的保藏物與保藏前的次級代謝產物情況發(fā)生了改變，產生次級代謝產物的穩(wěn)定性隨著保藏時間的延長而降低。經過兩年的保藏，斜面轉接保藏方法保藏的菌株M. anisopliade 和 F. oxysporum都喪失了產生胞外次級代謝物的特點，而用其它保藏方法的一部分菌株產生某些次級代謝產物的特點得以保存。在Ryan 研究中還發(fā)現(xiàn)，真菌的保藏方法對于菌株的次級代謝產物穩(wěn)定性保藏局限于“株”的水平上，對于同一種的不同菌株來說，同一保藏方法處理，得到的保藏結果可能就不一樣。真菌的次級代謝產物可以應用于分類學、教學研究以及應用于工業(yè)生產中，長期保藏過程中菌株次級代謝產物產生情況發(fā)生改變，帶來的后果將是十分嚴重。
真菌有產生多種胞外酶利用多種類型底物的能力，真菌酶作用機理、酶制劑的研究開發(fā)歷來受到重視，一些誘導酶，如脂肪酶、幾丁質酶、蛋白酶等具有降解復雜大分子結構物質的能力，在昆蟲、植物病害的生物防治中具有重要作用?；盍φ婢L期保藏對酶活力變化的影響長期存在。一些商業(yè)開發(fā)的檢測板，如APTZYM、API50CH以及Biolog檢測板可以用于分析真菌胞外酶活的變化情況 。Ryan在研究M. anisopliade 和 F.oxysporum發(fā)現(xiàn)，其胞外酶的分泌能力在長期保藏過程中發(fā)生改變，而酶活力是菌株生理穩(wěn)定性重要指標，不同保藏方法對酶活力的穩(wěn)定性同樣體現(xiàn)在“株”的水平上，而不是“種”的水平。Ryan在F. oxysporum菌株兩年的保藏試驗中發(fā)現(xiàn)，大多數的分離物喪失了α-甘露糖苷酶或β-木聚糖酶活性，殼二糖酶、葡聚糖酶和阿拉伯糖酶活性偶爾喪失 。M. anisopliade在兩年的低溫保藏試驗中，喪失了β-galacosidase α-fucosidase β-chitobiosidase β-glucuronidase的活性。M. anisopliadeM1菌株的leucine arylamidasde的活性在所有經過蒸餾水保藏的分離物中能夠檢測到，而在凍干和低溫保藏的分離物中部分能夠檢測到leucine arylamidasde的酶活。而對于tryspin的酶活檢測，在-20℃的低溫保藏處理和蒸餾水的保藏tryspin的酶活力情況保藏最好。
分子生物學在近20年的時間里發(fā)展較快，基于PCR技術使真菌長期保藏后的基因信息完整性檢測成為可能，如果真菌在保藏過程中基因信息發(fā)生缺失的話，那就有可能真菌的一些有價值的生理性狀、產酶能力遭到破壞。對于模式菌保藏過程中基因信息的缺失，在分子信息的分類研究中，完全有可能影響分類學的研究結果。Kumata等 注意到來自不同菌種保藏中心的同一個Trichoderma菌株，在PCR分子指紋分析中，得出了相偏離的結果。Kelly 等在對保藏了12年的F. oxysporum f.sp. ciceris菌株的一個分離物與其它分離物相比，沒有顯現(xiàn)出應有的典型分子特征 。Horgen結合RFLP與染色體分析，研究了Agaricus bisporus 菌株染色體丟失、退化情況 。Shinohara 等發(fā)現(xiàn)Saccharomyces cerevisiae 在450天內經過150次的轉接，菌株的染色體核型發(fā)生了微小的變化 。F. oxysporum f.sp.niveeum 菌株在連續(xù)轉接培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)DNA的甲基化現(xiàn)象 。斜面轉接、油管等保藏方法的機理是降低菌株的代謝速率，而凍干、超低溫保藏的機理是停止細胞代謝，目前對細胞代謝停止、恢復代謝后真菌基因信息、染色體信息是否完整的研究報道較少。
4 討論
避免真菌菌株在保藏過程中形態(tài)特征、生理生化性狀、基因信息的發(fā)生變化對于菌株的工業(yè)化生產、分類、教學研究具有重要意義。雖然真菌菌株在長期保藏中不可避免的出現(xiàn)致病力下降、酶活力下降、酶活性丟失，但從Ryan 等人的研究中可以發(fā)現(xiàn)，采用不同的保藏程序方法可以不同程度的降低菌株長期保藏過程中退化。此外，菌株在致病活性、酶活力性狀的長期保藏對保藏工藝選擇性體現(xiàn)在“株”的水平上，同一個種菌種的不同菌株也需要進行保藏工藝的研究才能保證其形態(tài)特征、生理生化特征的穩(wěn)定遺傳。對于一些真菌菌株誘導酶活性的丟失，一般情況下只要真菌菌株基因信息完整，在加入相應誘導物，真菌菌株會可能重新恢復一定的產酶能力，但酶活力的產量是否得到恢復視具體情況而定。對于一些生產性的真菌菌株或工程菌株來說，多是經過誘變、基因重組、基因突變或轉基因等手段得到，其基因組的穩(wěn)定性相對于野生菌株來說，穩(wěn)定性可能下降，此類菌株在長期保藏的過程中需要特殊的保藏工藝處理，才能夠保證基因信息的穩(wěn)定遺傳。