單個B 細胞PCR擴增抗體制備技術(shù)！
中國微生物菌種查詢網(wǎng) / 2019-03-04 09:07:01
目前單克隆抗體制備技術(shù)有雜交瘤技術(shù)、EBV 轉(zhuǎn)化B 淋巴細胞技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)以及單個B 細胞抗體制備技術(shù)等。
傳統(tǒng)的鼠雜交瘤單克隆抗體技術(shù)的基本過程是將來源于免疫接種過的小鼠的B 細胞與骨髓瘤細胞融合，繼而篩選出既能無限增殖又能分泌抗體的鼠雜交融合細胞，但是這種方法得到的鼠源抗體免疫原性高、半衰期短，往往臨床療效不顯著。即使是對鼠源單克隆抗體進行完全人源化的基因工程改造，也不可能完全消除鼠源單抗的免疫原性，對臨床療效的改善依然有限。
人雜交瘤技術(shù)是在鼠雜交瘤技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展的一種抗體制備技術(shù)，這種方法是將免疫過的人或鼠B 細胞與人骨髓瘤細胞融合從而獲得無限傳代且能分泌抗體的雜交融合細胞，該技術(shù)雖然克服了鼠雜交瘤技術(shù)免疫原性等不足，但是仍有較多局限，如人骨髓瘤細胞系非常有限、細胞融合成功率低且容易造成染色體丟失等。
針對于以上缺陷，研究者利用EB 病毒 (Epstein-Barr Virus，EBV) 在體外能感染正常靜止的B 細胞，使它們變成永生化的淋巴細胞系這一特性，制備分泌人單抗的雜交瘤細胞，即EBV 轉(zhuǎn)化B 細胞技術(shù)。然而，EBV 轉(zhuǎn)化B 細胞株不是惡性腫瘤細胞，較難克隆且抗體產(chǎn)量低，因而仍然沒有得到廣泛應用。
噬菌體展示技術(shù)是目前廣泛應用的體外篩選人源抗原特異性抗體可變區(qū)基因的一種方法，噬菌體展示是將抗體DNA 序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當位置，使抗體隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)。這種方法無需B 細胞培養(yǎng)過程、較為簡單，但是得到的抗體并非在人體中表達，可能導致構(gòu)象改變從而丟失抗原特異性，并且由于抗體重鏈和輕鏈隨機組合，無法保持抗體重鏈輕鏈的天然配對。
除此之外，轉(zhuǎn)基因鼠抗體制備技術(shù)在破壞鼠內(nèi)源抗體基因后導入人抗體基因，進而用目標抗原免疫轉(zhuǎn)基因鼠并在其體內(nèi)表達人源抗體，這種方法得到的抗體產(chǎn)量和親和力較高，但是鼠與人類免疫系統(tǒng)組成上的差異限制了其應用前景。
單個B 細胞抗體制備技術(shù)是一種體外克隆和表達單個抗原特異性B 細胞抗體基因技術(shù)，這種方法保留了輕重鏈可變區(qū)的天然配對，具有基因多樣性好、效率高、全人源、需要的細胞量少等優(yōu)勢。
單個B 細胞抗體制備技術(shù)過程
1.鑒定和分離單個B 細胞
細胞來源：外周血中分離漿細胞；外周血中分離單個記憶B 細胞；骨髓中分離前B 細胞。
在樣品豐富的情況下，為提高特異性抗體得率，可以在分離B 細胞之前先通過密度梯度法，或流式細胞分選從外周血中粗分離B淋巴細胞，以ELISPOT 進行抗原特異性細胞豐度的評價，從而選擇含抗原特異性抗體濃度較高的血樣進行后續(xù)抗體制備。
單個B 細胞分離可分隨機分離和抗原特異性分離，前者只需分離B 細胞，操作簡單，適用于抗原特異性抗體濃度較高的血樣，通常來自于疫苗接種者或患者，以盡量減輕后續(xù)抗體特異性鑒定的工作量。后者需分離抗原特異性B 細胞，操作較復雜，尤其適合抗腫瘤抗體、自身免疫抗體等特異性抗體含量較低的情況。
細胞分選時，通常需將單個B 細胞分至內(nèi)含適量細胞裂解液、RNA 酶抑制劑和PCR 反應試劑的適當容器中，如96 孔板。由于單個細胞內(nèi)RNA 含量少，適當?shù)娜萜骺梢苑奖愦笈坎僮?、防止樣品損失或交叉污染。另外，不同類型B 細胞抗體分泌能力差異明顯，如抗體分泌B 細胞中抗體基因轉(zhuǎn)錄本含量遠高于記憶B 細胞，因此從抗體分泌B 細胞中更容易擴增得到抗體基因。
2.擴增和克隆抗體基因
通常從單個B 細胞中擴增未知抗體基因，需使用合適的引物進行巢式或半巢式逆轉(zhuǎn)錄PCR(Nested or semi-nested RT-PCR)，該過程要求引物具有通用性、靈敏性、特異性，能避免非特異性擴增又能擴增出完整的抗體基因序列，因此合理設(shè)計引物序列至關(guān)重要。通常針對抗體重鏈輕鏈可變區(qū)不同前導序列設(shè)計前向引物的混合物，反向引物特異性互補于抗體恒定區(qū)。根據(jù)實驗目的，如果分離和擴增不同同種型的抗體，反向引物則是特異性互補于各種同種型抗體恒定區(qū)的混合物。
Ozawa 等通過5’ RACE (5’ rapid amplification of cDNA ends) 方法成功擴增出抗體基因編碼框5’端的完整序列，該方法通過針對不同同種型抗體恒定區(qū)保守序列的特異性反向引物序列GSP 引物（Gene-Specific Primer）混合物， 直接從細胞中RT-PCR 合成cDNA 第一鏈，對第一鏈加多聚G尾后（通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶TdT實現(xiàn)），繼續(xù)用一條帶有下游巢式PCR 引物互補序列和多聚C 的前向引物AP 合成第二鏈，進而利用針對AP 和恒定區(qū)保守序列的特異性引物混合物進行兩步巢式PCR，更加特異地擴增出目的基因。傳統(tǒng)的5’ RACE 法擴增未知基因的細胞含量要求較高，Ozawa 提出的單個B 細胞5’ RACE材料要求少至僅需一個細胞，且可能擴增出多種前向引物混合物PCR 的方法無法擴增出的抗體基因，另外過程中無需純化PCR 產(chǎn)物，省略了復雜的前向引物混合物，大大簡化了反應體系。
備注：末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶 TdT是一種模板非依賴型DNA聚合酶，催化在寡核苷酸、單鏈和雙鏈DNA的3’-OH重復添加脫氧核糖核苷酸。也就是說添加的這段序列是由我們給與的dNTP原料來決定的。
擴增出的抗體基因片段連接成scFv、scAb、Fab等形式，酶切將其構(gòu)建到原核或者真核表達載體中。
3.表達、篩選和鑒定抗原特異性抗體
鑒定抗體的抗原特異性和生物活性前需將攜帶有抗體基因的表達載體在相應系統(tǒng)中表達，最簡單常用的是原核表達系統(tǒng)，如Escherichia coli，相較而言，真核表達系統(tǒng)尤其是哺乳動物細胞表達系統(tǒng)更有利于抗體的加工修飾，其產(chǎn)物的生物活性可靠性更高，常用的有HEK293和CHO等細胞系。