雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）是人類和動(dòng)物（包括昆蟲）正常腸道內(nèi)微生物群主要成員之一現(xiàn)在已確認(rèn)雙歧桿菌是人體健康的重要標(biāo)志之一[國(guó)內(nèi)針對(duì)雙歧桿菌曾多次召開微生態(tài)學(xué)術(shù)討論會(huì),在國(guó)際上, 1990 年在日本舉行國(guó)際雙歧桿菌專題討論會(huì), 對(duì)雙歧桿菌的生理、生化、分類、作用機(jī)制及應(yīng)用進(jìn)行了廣泛而深入的探索, 還探討了雙歧桿菌的生物屏障、抗腫瘤、抗衰老、抗感染等方面的功用。下面將對(duì)雙歧桿菌的生物學(xué)特性及分類鑒定、生理功能、臨床應(yīng)用和其作為腫瘤基因載體菌方面的研究作一綜述。
1. 雙歧桿菌屬的發(fā)現(xiàn)及生物學(xué)特性
雙歧桿菌屬是 1899 年由 Tissier H. 首先從母乳營(yíng)養(yǎng)兒的糞便中分離出來，因其末端常常分叉,故命名為雙歧桿菌,并于 1906 年試圖把雙歧桿菌的肉湯培養(yǎng)物移植到該菌數(shù)量減少的嬰兒腸道中,用以提高對(duì)腸道疾病的抵抗力。雙歧桿菌無芽孢、莢膜及鞭毛，無運(yùn)動(dòng)性觸媒、硝酸鹽還原、靛基質(zhì)產(chǎn)生、及精氨酸水解均為陰性，是一類革蘭氏陽性、多形態(tài)桿菌。
菌體形狀呈 Y 字、V 字、彎曲狀和棍棒狀，形態(tài)受培養(yǎng)條件的影響，初代分離多呈分支或分歧狀，繼代培養(yǎng)后多呈現(xiàn)桿狀或棒狀。該菌初代分離時(shí)為專性的厭氧菌，但有的菌株在繼代培養(yǎng)后可變成微需氧，CO2 對(duì)該菌有生長(zhǎng)促進(jìn)作用。雙歧桿菌的菌落為 S 型，圓形凸起，周邊整齊，在血平板上，菌落為白色或乳白色，其最適宜生長(zhǎng)溫度 36－38℃,最適 PH6.5～7.0。
2.雙歧桿菌分子生物學(xué)分類鑒定
雙歧桿菌的分類經(jīng)歷了一段漫長(zhǎng)的歷史, 它曾一度被列入乳酸桿菌屬、放線菌屬、棒狀菌屬及丙酸桿菌屬，直到 1974 年才被正式確認(rèn)為雙歧桿菌屬。當(dāng)時(shí)雙歧桿屬包括 21 種，載入國(guó)際細(xì)菌分類專書《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)》(Bergeys Manual of Determinative Bacteridagy)第八版，現(xiàn)在已經(jīng)增加到 32 個(gè)種。
近年由于科技的進(jìn)步, 生物化學(xué)的研究深入, 遺傳學(xué)方面的研究進(jìn)展, 基因雜交、基因測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn), 使雙歧桿菌屬分類進(jìn)入一個(gè)嶄新的階段。DNA 探針雜交技術(shù)出現(xiàn)的最早,1992 年 Ito 首先成功的制備了短雙歧桿菌隨機(jī)引物探針。為了解決克隆探針同位素標(biāo)記污染問題，Tsutomu Kaneko 構(gòu)建了地高辛標(biāo)記的全染色體探針作為雙歧桿菌屬特異性探針。但這些方法因探針制備困難, 在實(shí)際應(yīng)用上受到了很大限制。rRNA 是體的主要組成成分,編碼它的 DNA 在基因組中具有中等拷貝數(shù), rRNA 中含有保守區(qū)和可變區(qū), 其中存儲(chǔ)著大量的分類學(xué)信息。日本學(xué)者 Miyake 等測(cè)定了 21 種雙歧桿菌 16s rRNA 全序列一起進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析, 構(gòu)建了比較完善的雙歧桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹。16s RNA 寡核苷酸探針制備簡(jiǎn)單、特異性好, 目前應(yīng)用比較廣泛。
基于雙歧桿菌探針的種種缺隱, 人們開始研究 PCR 技術(shù)。PCR 引物是在 DNA 探針基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的。 常規(guī) PCR 程序?qū)兣囵B(yǎng)株展現(xiàn)出特異性,但有些菌株之間如嬰兒雙歧桿菌與蜜蜂雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌與假長(zhǎng)雙歧桿菌存在交叉反應(yīng)。熒光原位雜交 PCR 是選用 20 個(gè)堿基以內(nèi)的寡核苷酸作為特異性探針, 與目的 DNA 進(jìn)行雜交, 進(jìn)行常規(guī) PCR 擴(kuò)增。 這種方法將雜交的高度特異性和 PCR 的高度靈敏度完美地結(jié)合起來, 有非常大的應(yīng)用前景。分子標(biāo)記是指可遺傳并可檢 DNA 序列, 它直接以 DNA 的形式出現(xiàn), 在生物的各個(gè)生長(zhǎng)期均可檢測(cè)到, 不受季節(jié)、 環(huán)境的限制, 不存在表達(dá)與否的問題, 數(shù)量極多, 遍及整個(gè)基因組， 不需專門創(chuàng)造特殊的遺傳材料。目前常用的分子標(biāo)記技術(shù)有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA (RAPD)以及簡(jiǎn)單序列重復(fù)程度多態(tài)性分析(微衛(wèi)星 DNA 或 SSLP)。 近年來分子標(biāo)記技術(shù)在雙歧桿菌鑒定方面也有報(bào)道。 Roy 等采用 RA PD 技術(shù)對(duì) 5 種乳品雙歧桿菌進(jìn)行擴(kuò)增, 得到重復(fù)、穩(wěn)定的 RADP 指紋圖譜, 通過與標(biāo)準(zhǔn)菌株比較, 可正確的鑒定出不同的雙歧桿菌菌株。 RADP 是一種新的揭示基因組多態(tài)性的方法, 它已在種屬特異性鑒定和基因水平分型中得到高度重視。 張麗娟等(1999) 對(duì) 20 株四種雙歧桿菌做 PCR 指紋分析,可明顯見到四種雙歧桿菌所共有的三條帶, 794bp、478bp、366bp 為屬特異性帶, 其它帶為種特異帶。RAPD 具有簡(jiǎn)便、快速、檢出率高, 無需知道目的基因遺傳背景, 引物通用, 重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn), 是一種分子水平上對(duì)細(xì)菌尤其是表型鑒定較難的厭氧菌屬鑒定分型的好方法。
3．雙歧桿菌的生理功能
3. 1 生物屏障和生物拮抗作用
雙歧桿菌作為腸道中的優(yōu)勢(shì)菌，與其他正常菌群一起構(gòu)成了阻止外來菌入侵的生理屏
障。雙歧桿菌進(jìn)入腸道后能否黏附于宿主腸道黏膜上皮細(xì)胞表面,形成穩(wěn)定的菌群,是關(guān)系到
其是否能起到生物屏障和生物拮抗作用的重要前提.Matsumoto 等觀察了不同類型的雙歧桿菌、類桿菌、真桿菌、梭狀芽胞桿菌、大腸埃希菌等對(duì)腸黏膜的黏附作用,發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌 L
KM512 菌株的黏附率是其他細(xì)菌的 2～100 倍。雙歧桿菌黏附于腸黏膜上皮細(xì)胞上,通過自
身及產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物排斥致病菌,在腸道中保持菌種優(yōu)勢(shì),并與其他菌群相互作用,調(diào)整菌群間的關(guān)系,以保證腸道菌群最佳組合,并維持腸道功能的平衡。
關(guān)于雙歧桿菌對(duì)腸道病原體生物拮抗作用的機(jī)理，目前認(rèn)為有以下幾種可能：
（1）通過雙歧桿菌細(xì)胞壁的磷壁酸與腸黏膜上皮細(xì)胞特異性結(jié)合，從而占據(jù)腸粘膜表面, 形成與腸上皮細(xì)胞相連接的細(xì)菌生物膜, 起到占位性保護(hù)作用，從而阻止各種致病菌、條件致病菌的定值、入侵。葉桂安等報(bào)道，由蛋白質(zhì)介導(dǎo)的雙歧桿菌能特異地粘附于體外培養(yǎng)的腸上皮細(xì)胞。
（2）雙歧桿菌能合成結(jié)合膽汁酸水解酶，可分解結(jié)合性膽酸為游離膽酸，游離態(tài)膽酸抑菌作用較結(jié)合態(tài)膽酸強(qiáng)，從而具有抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)作用。Grill 報(bào)道雙歧桿菌能產(chǎn)生結(jié)合膽酸水解酶，使結(jié)合膽酸游離，更有效地抑制致病菌的生長(zhǎng)，但缺乏膽酸 7α-脫羥基酶，因而避免二級(jí)膽汁酸生成，而后者是病原體生長(zhǎng)繁殖所需要的。
（3）雙歧桿菌能分泌胞外糖苷酶， 降解腸黏膜上皮細(xì)胞上與致病菌和內(nèi)毒素結(jié)合受體的復(fù)雜多糖， 從而阻止致病菌對(duì)腸黏膜細(xì)胞的侵襲。Falk 研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌能夠產(chǎn)生細(xì)胞外α-,β-糖苷酶，這些酶可以降解腸道黏蛋白低聚糖和乳酸系列Ⅰ型糖鞘脂，阻止細(xì)菌侵襲。
（4）在代謝過程中經(jīng)由特殊途徑的雙歧桿菌支路產(chǎn)生有機(jī)酸，如乙酸、乳酸和甲酸等，能顯著降低環(huán)境中的 pH 值和氧化還原
電勢(shì)(Eh)抑制致病菌繁殖，從而形成腸道的化學(xué)保護(hù)屏障，抑制非正常菌群如痢疾桿菌、 傷寒桿菌、變形桿菌、綠膿桿菌和真菌的生長(zhǎng)及其有害代謝物的產(chǎn)生。 其中，乙酸的抑菌作用最強(qiáng)，乳酸次之。
（5）調(diào)節(jié)和協(xié)調(diào)其他腸道菌群，促進(jìn)腸蠕動(dòng)，使致病菌粘附到腸黏膜上皮的機(jī)會(huì)減少。
（6）產(chǎn)生類似細(xì)菌素的蛋白質(zhì),有一定的殺菌作用。國(guó)外學(xué)者報(bào)道動(dòng)物雙歧桿菌雖然不能完全阻止白色念珠菌病的發(fā)生， 但是能夠明顯降低念珠菌病的發(fā)病率和緩解
病情。此外雙歧桿菌還能產(chǎn)生 H2O2 ,從而激活機(jī)體產(chǎn)生過氧化氫酶,抑制和殺滅革蘭陰性菌,
如志賀菌和沙門菌等。
3. 2 增強(qiáng)免疫功能、延緩機(jī)體衰老
雙歧桿菌的免疫調(diào)節(jié)作用是重要的,對(duì)超敏反應(yīng)、免疫低下、免疫排斥及口服免疫耐受性都起重要作用。 它能通過菌體抗原及代謝產(chǎn)物刺激腸黏膜淋巴結(jié),激活免疫活性細(xì)胞, 提高自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活性,產(chǎn)生特異性抗體和致敏淋巴細(xì)胞,調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答。激活巨噬細(xì)胞的β－半乳糖苷酶活性,加強(qiáng)和促進(jìn)其吞噬作用。人體內(nèi)腐生菌的代謝產(chǎn)物如吲哚、甲酸、氨等,如不及時(shí)清除,可導(dǎo)致肝功能、循環(huán)系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)功能異常,雙歧桿菌能抑制腐生菌的生長(zhǎng),從而有效地防止了有毒物質(zhì)的產(chǎn)生；它還能以氨為氮源在腸道內(nèi)合成氨基酸和尿素,從而降低了血氨濃度,提高體內(nèi)蛋白質(zhì)積蓄。雙歧桿菌菌體成分或代謝產(chǎn)物具有抗膽固醇功能,能明顯減少腸管對(duì)膽固醇的吸收,同時(shí)促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懰猁},從而加快其排出體外,對(duì)延緩機(jī)體衰老有積極作用。藍(lán)景剛給小鼠腹腔注射雙歧桿菌發(fā)現(xiàn)小鼠脾 N K、LA K 細(xì)胞活性增強(qiáng), 腹腔局部巨噬細(xì)胞來源的細(xì)胞因子 IL- 1、TN F、IL - 6 活性增強(qiáng)。Madsen 等將凍干的長(zhǎng)雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和短雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和植物乳桿菌及唾液鏈球菌嗜熱亞種制成益生菌復(fù)合物。 每天管飼小鼠 4 周后發(fā)現(xiàn)益生菌復(fù)合物能使小鼠的大腸生理功能和腸上皮緊密連接的完整性趨于正常,黏膜分泌 TNF 和干擾素減少， 組織學(xué)病變改善。蔡訪勤等人在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)給小鼠腹腔注射雙歧桿菌, 原位激活后, 由肝臟分離的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(NPC) 對(duì) YAC-1、P815、L 929 三株瘤細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用, 同時(shí)胸腺細(xì)胞和脾細(xì)胞對(duì) Con A 刺激的增殖反應(yīng)明顯增強(qiáng), 脾細(xì)胞產(chǎn)生的 TNF 活性也增強(qiáng)。王立生等研究表明雙歧桿菌具有免疫賦活作用, 能激活機(jī)體免疫系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞、 N K 細(xì)胞以及 B淋巴細(xì)胞, 提高機(jī)體的特異性及非特異性免疫功能。Marin ML 報(bào)道各種雙歧桿菌都能直接與巨噬細(xì)胞相互作用, 增加 IL - 6 和α- TNF 細(xì)胞因子的產(chǎn)量。蔣虹等報(bào)道雙歧桿菌可以產(chǎn)生一些耐熱的抗菌物質(zhì), 可以耐受 100 ℃ 30 min 抑制致病菌的生長(zhǎng), 提高局部和全身的防御功能。
3. 3 營(yíng)養(yǎng)作用
雙歧桿菌體內(nèi)含有大量的消化酶， 能消化一些宿主機(jī)體內(nèi)依靠本身的酶系不能消化的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。 同時(shí)，雙歧桿菌直接或間接地參與維生素如硫胺素、核黃素、尼克酸、吡哆醇、泛酸、葉酸和維生素 B12 等的合成、吸收和利用，并能以氨為氮源在腸道內(nèi)合成氨基酸和尿素， 從而有效降低血氨濃度， 提高體內(nèi)蛋白質(zhì)積蓄。 另外，雙歧桿菌通過抑制某些維生素分解菌來保障體內(nèi)維生素的供應(yīng)，如抑制分解維生素 B1 的芽孢桿菌，通過改變腸道內(nèi)微生物構(gòu)成，保證機(jī)體對(duì)維生素的需要。雙歧桿菌在腸內(nèi)發(fā)酵后能產(chǎn)生乳酸和醋酸,可降低環(huán)境 pH 值,亦有利于二價(jià)鐵、鈣及維生素 D 的吸收。雙歧桿菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)生的半乳糖是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)中腦苷脂的成分, 與嬰兒出生后腦的迅速生長(zhǎng)有密切關(guān)系。雙歧桿菌還可以改善蛋白質(zhì)的代謝,如產(chǎn)生的蛋白磷酸酶可將乳汁中α－酪蛋白降解, 提高蛋白質(zhì)消化吸收率。有些人腸道中缺乏β-半乳糖苷酶, 致使對(duì)半乳糖消化不良, 服用麗株腸樂(雙歧桿菌活菌制劑), 能夠明顯改善乳糖消化不良癥狀。Jenkins DJ 等報(bào)道雙歧桿菌可利用結(jié)腸部位不被消化的寡糖產(chǎn)生短鏈脂肪酸如 L -乳酸。
3. 4 抑制腫瘤的作用
雙歧桿菌的抗腫瘤作用機(jī)理除了公認(rèn)的增強(qiáng)人體的免疫功能, 非特異性增強(qiáng)腫瘤局部反應(yīng), 改善腫瘤病人淋巴細(xì)胞亞群分布和促進(jìn)細(xì)胞免疫功能等方面的免疫調(diào)節(jié)作用外, 據(jù)報(bào)道還能減少腸內(nèi)致癌物的形成, 同時(shí)使某些誘發(fā)癌癥的酶失活, 誘發(fā)癌癥凋亡基因的表達(dá)。
雙歧桿菌的抗腫瘤作用包括活菌體、 滅菌體及細(xì)胞壁骨架的抗腫瘤作用。 其作用機(jī)制主要是激活機(jī)體的免疫統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞,促進(jìn)其分泌具有抗腫瘤活性的細(xì)胞因子,如 IL-G 和 TNF－α等間接發(fā)揮抑制腫瘤的作用。另外,雙歧桿菌菌體細(xì)胞壁的肽聚糖、磷壁酸和多糖都有抗腫瘤作用。
蔣虹等發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌脂磷壁酸 （LTA） 作用于大腸癌 LoVo 細(xì)胞后能增強(qiáng) LAK 對(duì)該細(xì)胞的識(shí)別和殺傷，并認(rèn)為其機(jī)制可能在于 LTA 通過上調(diào) LoVo 細(xì)胞上 ICAM-1 的表達(dá)，增強(qiáng)了LAK 對(duì)其的識(shí)別和結(jié)合。張金潔等發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌及其細(xì)胞壁肽聚糖（WPG）通過刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一些活性因子(IL-G、 INF-α)而間接發(fā)揮抑瘤作用。Sekine 等以皮下接種了 Meth A纖維肉瘤的小鼠作為動(dòng)物模型研究了嬰兒型雙歧桿菌細(xì)胞壁的3種成分即完整肽聚糖(wholepeptidoglycan．WPG)、超聲處理過的 WPG 以及細(xì)胞壁骨架對(duì) Meth A 纖維內(nèi)瘤的影響，結(jié)果證實(shí)將上述任一種成分與瘤細(xì)胞混合接種到 BALB／C 小鼠皮下， 均能明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)。若將上述成份分別注射于荷瘤鼠的瘤體內(nèi)，抑瘤率可分別達(dá)到 70% 、40% 及 2O%。
實(shí)驗(yàn)證明,雙歧桿菌的抗腫瘤作用是肯定的,但只是實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)方面的成果,怎樣把這些成果應(yīng)用于臨床,還要進(jìn)行更多的細(xì)致的研究工作。
4．雙歧桿菌的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀
4．1 雙歧桿菌對(duì)腸道疾病的防治
據(jù)我國(guó)衛(wèi)生部材料統(tǒng)計(jì),每年約 8. 36 億次患急性感染性腹瀉,其< 5 歲小兒約 2. 09 億人次,是發(fā)病最多的年齡段?？岛暧畹炔捎名愔槟c樂(雙歧桿菌) 治療小兒腹瀉,治療組 50 例,對(duì)照組 45 例,治療組服用麗珠腸樂膠囊 1 粒,2 次/ d ,對(duì)照組服用乳酸菌素片 1 片,2 次/ d ,6天為 1 個(gè)療程,結(jié)果是治療組總有效率為 98. 0 %,對(duì)照組為 55. 6 %,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P< 0. 01) ;施榮杰采用麗珠腸樂治療急性腹瀉,治療組62 例,對(duì)照組58 例,治療組服用麗珠腸樂膠囊 2 粒,3 次/ d ,對(duì)照組服用慶大霉素片 8 萬單位,3 次/ d ,5 天為 1 個(gè)療程,結(jié)果是治療組總有效率為 91. 93 %,對(duì)照組有效率為 79. 31 %,兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P < 0. 05) ;張捷等采用金雙歧治療腸易激綜合征,按“羅馬標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ”的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為該病患者142 例,口服金雙歧 2. 0 g ,2 次/ d ,2 周為 1 個(gè)療程,觀察期間記錄治療前后每天的包括腹痛、腹脹、排便頻率和和大便性狀及不良反應(yīng)。結(jié)果是治療 1 周,總有效率為 65. 4 %,治療 2 周,總有效率為85. 2 %,無 1 例發(fā)生不良反應(yīng),療效確切,患者依從性好,值得推廣應(yīng)用。
4．2 雙歧桿菌在控制內(nèi)毒素血癥中的作用
內(nèi)毒素是革蘭陰性菌最外層的結(jié)構(gòu), 是一種大分子脂多糖, 在感染或使用抗生素導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)的情況下, 受抑制的腸道細(xì)菌大量繁殖, 產(chǎn)生大量?jī)?nèi)毒素, 導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥。人體腸道中內(nèi)毒素 90% 以上來源于腸腔內(nèi)革蘭陰性桿菌的釋放與裂解, 腸道內(nèi)毒素池的變化與 G- 菌消長(zhǎng)有密切關(guān)系。雙歧桿菌可以改善腸道 PH 值, 抑制有害菌的產(chǎn)生, 同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合腸粘膜位點(diǎn), 阻止致病菌定值、入侵及細(xì)菌易位, 顯著縮小內(nèi)毒素池。曾有多篇報(bào)道雙歧桿菌通過調(diào)節(jié)腸道菌群減少內(nèi)毒素生成或吸收, 從而使血中內(nèi)毒素水平下降, 減輕對(duì)其它臟器的損害。
4．3 輔助治療肝病
我國(guó)乙型肝炎病毒攜帶者達(dá) 1. 3 億人,每年乙型肝炎的發(fā)病人數(shù)達(dá) 1 千 3 百萬。盡管目前干擾素、拉米夫定等抗病毒藥物在臨床已得到廣泛的應(yīng)用,但慢性病毒性肝炎發(fā)展為肝硬化、慢性重型肝炎的勢(shì)頭并未因此得到有效的遏制。李強(qiáng)等采用金雙歧活菌片(主要成分為長(zhǎng)雙歧桿菌) 對(duì)乙肝肝硬化患者進(jìn)行療效觀察。 治療組和對(duì)照組各 43 例,治療方法為治療組在普通支持療法的基礎(chǔ)上加用金雙歧片 12 片/ d ,對(duì)照組僅用普通支持療法,2 個(gè)月為 1 個(gè)療程。結(jié)果表明,治療組中腹脹、腹瀉、便秘、納差、乏力癥狀的緩解率及 AL T 復(fù)常率、T－BiL 復(fù)常率均明顯高于對(duì)照組;治療組中血氨、Child－Pugh 分?jǐn)?shù)均明顯低于對(duì)照組,金雙歧活菌片治療乙肝肝硬化安全、有效,其療效優(yōu)于對(duì)照組。腸道菌群紊亂與肝功能損害程度密切相關(guān),正確使用微生態(tài)制劑可以維護(hù)肝硬化患者的腸道微生態(tài)平衡,減少內(nèi)毒素的產(chǎn)生和吸收,對(duì)穩(wěn)定肝病患者的病情起著積極的作用。
4．4 臨床抗腫瘤研究
雙歧桿菌不僅在動(dòng)物體內(nèi)具有一定的抗腫瘤作用， 許多學(xué)者在臨床方面也作了很多有益的探索。Kubota 等分析了 4O 側(cè)大腸腺瘤及 56 側(cè)大腸癌患者的腸道苗群．結(jié)果發(fā)現(xiàn)腺瘤及癌患者腸道內(nèi)雙歧桿菌的數(shù)量顯著降低， 而致病性的梭狀芽胞桿菌則增多． 且隨著腺瘤不典型增生程度的加重．雙歧桿菌的數(shù)量也進(jìn)行性下降，大腸癌患者的數(shù)量最低，提示大腸腺瘤及癌的發(fā)生與演進(jìn)與雙歧桿菌數(shù)量的減少具有一定的關(guān)聯(lián)，另一方面 Ishihara 等將雙歧桿菌用于臨床腫瘤的治療也取得了一定的效果．他們將雙歧桿菌的 WPG、1L-2、TNF-α、IFN－γ及 OK-432 等生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑注射到惡性黑色寨瘤患者的皮膚轉(zhuǎn)移灶內(nèi)． 結(jié)果表明 WPG 能使腫瘤轉(zhuǎn)移灶縮?。Чc IFN－γ相當(dāng)，并且無任何毒副作用。Korshunov 等則調(diào)查了 39例患有宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)的生育期婦女的陰道菌群，也發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌的數(shù)量顯著下降。使用促進(jìn)該菌生長(zhǎng)的藥物,Solco-Trichovac 能使部分患者的 CIN 減輕甚至消退，說明維持陰道內(nèi)雙歧桿菌的正常數(shù)量對(duì)預(yù)防和治療宮頸癌均具有重要意。
5．雙歧桿菌作為基因載體在腫瘤治療中的應(yīng)用
腫瘤治療依然是當(dāng)前人類急需解決一個(gè)重大課題，目前腫瘤雖有多種治療手段,但主要還是以手術(shù)為主、放療、化療和生物治療為輔的綜合治療,大多數(shù)腫瘤的治療效果不甚理想。隨著分子生物學(xué)和重組 DNA 技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展，腫瘤的基因治療為腫瘤的治療帶來了新的曙光?；蛑委煆V義上的定義是指將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi),使其在體內(nèi)發(fā)揮作用,以達(dá)到治療疾病的目的， 基因治療的方法已成為全球許多醫(yī)藥學(xué)和生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的研究重點(diǎn)。
基因治療概述
基因治療(genetherapy) 是新近發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù),經(jīng)典的基因治療指在基因水平上對(duì)遺傳缺陷進(jìn)行糾正,它主要是向靶細(xì)胞或組織中引入外源基因 DNA 或 RNA 片段,以糾正或補(bǔ)償基因的缺陷,關(guān)閉或抑制異常表達(dá)的基因,從而達(dá)到治療的目的。通常包括基因置換、基因修正、基因修飾、基因失活等 34?，F(xiàn)在基因治療已從對(duì)單基因缺陷性遺傳病的基因替代治療,拓展至對(duì)致病基因的修正和基因增強(qiáng)治療,以及采用外源調(diào)理性細(xì)胞因子基因、核酶
類及反義核酸類基因藥物進(jìn)行治療。
基因治療的靶細(xì)胞可分為兩大類:體細(xì)胞和生殖細(xì)胞。將遺傳物質(zhì)引入人的體細(xì)胞進(jìn)行基因治療的方法稱為體細(xì)胞基因治療( somatic cell genetherapy);以生殖細(xì)胞為對(duì)象的基因治療稱為生殖細(xì)胞基因治療(germ cell genetherapy)。 上世紀(jì) 80 年代初,Anderson 首先闡述了基因治療的概況。 1990 年美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的 Blease 等成功地進(jìn)行了世界上首例臨床基因治療,即腺苷脫氨酶(adenosinede－aminase, ADA) 缺陷病的人體基因治療。1991 年我國(guó)首例基因治療 B 型血友病也獲得成功。近年來,這一領(lǐng)域的研究取得了重大進(jìn)展,基因治療作為一種全新的疾病治療手段,將在一定程度上改變?nèi)祟惣膊≈委煹臍v史進(jìn)程。
基因治療的方法
基因治療常用方法有兩種,即體內(nèi)療法(invivo) 和體外療法(exvivo) 。 體內(nèi)療法是將外源-基因?qū)胧荏w體內(nèi)有關(guān)的器官組織和細(xì)胞內(nèi),以達(dá)到治療目的。這是一種簡(jiǎn)便易行的方法,如肌肉注射、靜脈注射、器官內(nèi)灌輸、皮下包埋等,但其缺點(diǎn)是基因轉(zhuǎn)染率較低。目前研究和應(yīng)用較多的還是體外療法,即先在體外將外源基因?qū)胼d體細(xì)胞,然后將基因轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞回輸給受者,使攜有外源基因的載體細(xì)胞在體內(nèi)表達(dá)治療產(chǎn)物,以達(dá)到治療目的。
腫瘤基因治療載體的特點(diǎn)和類型
在基因治療中一個(gè)非常關(guān)鍵的技術(shù)問題就是載體的選擇， 理想的治療載體應(yīng)具備以下特點(diǎn):
①易于進(jìn)入靶細(xì)胞;
②在特異細(xì)胞或組織中達(dá)到有規(guī)律、充分及持續(xù)的外源基因表達(dá);
③安全有效并具有選擇性;
④易于大量生產(chǎn)。目前應(yīng)用于基因治療研究的基因轉(zhuǎn)移載體主要分為病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒性載體包括反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、單純皰疹病毒載體、腺病毒相關(guān)病毒載體、痘病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體、仙臺(tái)病毒載體、雜交病毒載體等，病毒性載體其優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率高,但其存在免疫原性、細(xì)胞毒作用、攜帶外源基因的大小受限和病毒滴度不易提高等問題， 其安全性問題始終存在。 非病毒性載體包括真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒載體、非生物性的聚合物載體、聚賴氨酸、聚乙烯亞胺、殼聚糖、明膠基系統(tǒng)、陽離子縮氨酸、人工染色體、活菌載體等，非病毒性載體雖然轉(zhuǎn)染效率較低,但是其突出的優(yōu)點(diǎn)就是安全、制備簡(jiǎn)單和巨大的攜帶外源基因的容量。
現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外學(xué)者正在集中研究和解決基因治療的載體問題,主要是利用各種技術(shù)提高載體的靶向性和轉(zhuǎn)染效率,解決外源基因在體內(nèi)的表達(dá)調(diào)控和有效性,這些都是目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行載體研究的熱點(diǎn)。
雙歧桿菌作為腫瘤基因治療載體研究細(xì)菌具有一定的抗腫瘤作用,而且某些細(xì)菌具有腫瘤靶向作用,它們可以在腫瘤組織內(nèi)復(fù)制、增生,而在正常組織內(nèi)被清除。目前已經(jīng)被應(yīng)用于腫瘤治療的菌包括，鼠傷寒沙門氏菌、梭狀芽胞桿菌、以及雙歧桿菌。在這些被用來作為腫瘤基因治療的菌中，雙歧桿菌作宿主有益的生理菌并具有在腫瘤低氧壞死區(qū)定植繁殖的特點(diǎn)而備受關(guān)注。
在過去幾年中，構(gòu)建雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭載體已見報(bào)道，如基于長(zhǎng)雙歧桿菌衍生質(zhì)粒 pMB1 構(gòu)建的穿梭載體 pRM2、pNC7、pDG7 和基于 B. longum KJ 衍生質(zhì)粒 pKJ50 構(gòu)建的 pBKJ50F 和 pBKJ50R。 但是這些穿梭載體不能在雙歧桿菌中表達(dá)外源基因。 到目前為止，已經(jīng)有長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒型雙歧桿菌、動(dòng)物型雙歧桿菌以及青春型雙歧桿菌被成功轉(zhuǎn)導(dǎo)了穿梭質(zhì)粒。本實(shí)驗(yàn)室前期研究了含 endostatin 的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒 pBV222 在雙歧桿菌中表達(dá) Endostatin 和抗腫瘤效果， 發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒 pBV222 能在雙歧桿菌中表達(dá) Endostatin ，但發(fā)現(xiàn) pBV222 相對(duì)于雙歧桿菌來說是外源 DNA，很容易就被其 DNA 酶降解，所以不能穩(wěn)定存在于雙歧桿菌中。因此，在基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)室又構(gòu)建了 pBV22210-endostatin 質(zhì)粒，該質(zhì)粒以 pBV222 為構(gòu)建基礎(chǔ)，插入雙歧桿菌敏感的氯霉素抗性基因(Cmr)以及來自長(zhǎng)雙歧桿菌的質(zhì)粒 pMB1，并將具有抑制血管生長(zhǎng)的內(nèi)皮抑素基因克隆入該質(zhì)粒載體，結(jié)果顯示該質(zhì)粒能夠在長(zhǎng)雙歧桿菌中穩(wěn)定存在并表達(dá)目的蛋白，此外，抗腫瘤活性研究結(jié)果顯示含pBV22210-endostatin 質(zhì)粒的長(zhǎng)雙歧桿菌可顯著抑制小鼠肝癌實(shí)體瘤的生長(zhǎng)。 Park MS.等構(gòu)建了 pBES16PR-CHOL 質(zhì)粒，該質(zhì)粒以 16S rRNA 的啟動(dòng)子序列作為其啟動(dòng)子，并將膽固醇氧化酶結(jié)構(gòu)基因科隆入質(zhì)粒中， 研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)了該質(zhì)粒的長(zhǎng)雙歧桿菌， 其細(xì)胞提取液具有膽固醇氧化酶活性。Reyes Escogido ML 構(gòu)建了 PL-10 質(zhì)粒，該質(zhì)粒能夠在雙歧桿菌和大腸桿菌中可溶性表達(dá) rhIL-10 蛋白。此外 Hidaka 等將胞嘧啶脫氨酶基因克隆到 pAV001-HU-eCD.穿梭質(zhì)粒中。 并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了 B. breve I-53-8w短雙歧桿菌和 B. longum aE-194b, B. longumbs-601,and B. longum 105A 三種長(zhǎng)雙歧桿菌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明均能夠表達(dá)胞嘧啶脫氨酶蛋白，其中以短雙歧桿菌的表達(dá)量最高，并且該質(zhì)粒能夠在該菌中穩(wěn)定存在。
6. 問題及展望
目前，對(duì)雙歧桿菌的研究和醫(yī)學(xué)應(yīng)用巳進(jìn)入了一個(gè)全新的時(shí)期。如果說，雙歧桿菌研究
應(yīng)用的第一階段是發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌在微生態(tài)平衡中的重要作用并應(yīng)用于保健和一些慢性疾患的輔助治療。 第二階段是證實(shí)雙歧桿菌的非特異性免疫增強(qiáng)和調(diào)節(jié)作用并應(yīng)用于抗腫瘤輔助治療。今天，雙歧桿菌的研究應(yīng)用巳進(jìn)入第三階段即作為抗腫瘤基因治療的導(dǎo)向載體。理論上，凡對(duì)實(shí)體瘤有治療作用的基因，諸如血管生長(zhǎng)抑制因子的基因，腫瘤自殺基因，校正和修復(fù)突變的癌基因的基因片段， 具有殺傷瘤細(xì)胞的淋巴因子的編碼基因等， 均可用雙歧桿菌作為導(dǎo)向載體。 雙歧桿菌很可能為惡性腫瘤的治療提供新的契機(jī)。 當(dāng)務(wù)之急是要對(duì)雙歧桿菌的基因組成，遺傳穩(wěn)定性等作進(jìn)一步深入的研究。