歡迎訪問中國微生物菌種查詢網(wǎng)，本站隸屬于北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司，單位現(xiàn)提供微生物菌種及其細(xì)胞等相關(guān)產(chǎn)品查詢、咨詢、訂購、售后服務(wù)！與國內(nèi)外多家研制單位，生物醫(yī)藥，第三方檢測機(jī)構(gòu)，科研院所有著良好穩(wěn)定的長期合作關(guān)系！
1、真菌培養(yǎng)
真菌培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)室檢查中的重要環(huán)節(jié)，培養(yǎng)出致病真菌是進(jìn)一步鑒定菌種的前提條件。真菌培養(yǎng)第一步是從臨床標(biāo)本中培養(yǎng)真菌的初代培養(yǎng)，初代培養(yǎng)后進(jìn)一步進(jìn)行分離純化培養(yǎng)和鑒定培養(yǎng)。不同致病真菌每一步所采用的培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度存在一定的差異。常規(guī)的真菌培養(yǎng)需要在28-30°C溫度下培養(yǎng)3-4 周，一般初代培養(yǎng)選用沙氏培養(yǎng)基（SDA）或者馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA），采用試管培養(yǎng)，一般同時培養(yǎng)兩管，其中一管可添加抗生素（氯霉素或慶大霉素均 可）。在培養(yǎng)1周內(nèi)，應(yīng)該每天觀察有無真菌生長。一般培養(yǎng)4周后，如果無真菌生長可報陰性。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)出真菌，直接挑取少量菌體或者小培養(yǎng)后，用乳酸酚棉蘭制成涂片顯微鏡下觀察，結(jié)合菌落大體形態(tài)，典型菌種可直接報告種屬。不典型菌種根據(jù)基本表現(xiàn)，采用適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)鑒定培養(yǎng)基，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件培養(yǎng)，必要時要結(jié)合 生理學(xué)和分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。
2、真菌鑒定
對常見致病真菌要掌握的鑒定原則是首先區(qū)分酵母菌和霉菌。
如果初代培養(yǎng)基上培養(yǎng)出酵母樣菌落，在鑒定前應(yīng)進(jìn)行分離純化。在去除細(xì)菌和其他真菌污染，區(qū)分混合感染后，對純菌落進(jìn)行鑒定。酵母菌鑒定主要根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和生理生化特點(diǎn)，按照一定的流程進(jìn)行。首先根據(jù)菌落顏色進(jìn)行分類。臨床最為常見的是白色或奶白色菌落，這類菌進(jìn)一步做芽管試驗(yàn)，若芽管試驗(yàn)是陽性則為白 念珠菌，若陰性則通過Vitek YBC或API20C及玉米吐溫瓊脂上培養(yǎng)的形態(tài)特征來鑒定。另外，還可以應(yīng)用念珠菌顯色瓊脂、尿素酶試驗(yàn)等試驗(yàn)來輔助鑒定。
霉菌的鑒定非常復(fù)雜，有許多標(biāo)準(zhǔn)包括形態(tài)學(xué)特征、溫度耐受性，放線菌酮抗性、雙相性、營養(yǎng)需求、蛋白分解活動以及水解尿素能力等?，F(xiàn)代分類學(xué)鑒定方法主要依據(jù)分生孢子的個體發(fā)生過程結(jié)合其他特征來進(jìn)行鑒定。初代培養(yǎng)后根據(jù)形態(tài)學(xué)特征一般可鑒定到屬的水平，再依據(jù)不同真菌的鑒定要求，采用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條 件進(jìn)一步完成菌種鑒定。例如：曲霉屬鑒定時需要采用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，即察氏培養(yǎng)基和麥芽瓊脂，25℃培養(yǎng)7天后與曲霉形態(tài)鑒定檢索表對應(yīng)得到正確的結(jié)果。
（一）形態(tài)學(xué)鑒定
1、菌落形態(tài)觀察 致病真菌的形態(tài)學(xué)鑒定的第一步就是要區(qū)別不同的菌落特征。即酵母型菌落或絲狀型（霉菌）菌落。對霉菌通常采用形態(tài)學(xué)鑒定為主, 而酵母菌常需采用形態(tài)和生理相結(jié)合的手段。觀察真菌菌落時應(yīng)注意菌落大小、形態(tài)、色素、顏色和質(zhì)地。
2、顯微鏡檢查 為充分在鏡下觀察真菌結(jié)構(gòu)，必須用分離針挑出一部分菌落進(jìn)行觀察。常用乳酸酚苯胺藍(lán)(LPCB，棉藍(lán))對挑取的部分菌落進(jìn)行染色。此項(xiàng)操作必須在生物安全柜中進(jìn)行。樣本需要保存時可用指甲油封邊。小培養(yǎng)、覆蓋培養(yǎng)、透明膠帶法等均是常用的方法。
3、玻片培養(yǎng) 是一種特殊的玻片作成的培養(yǎng)小室，可以更為清楚地觀察真菌孢子和分生孢子的形成及位置。涉及小培養(yǎng)的所有操作均應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行?？蛇x用馬鈴薯瓊脂、玉米瓊脂或V-8果汁做培養(yǎng)基。
4、透明膠帶法 用透明膠帶粘取菌落表面置于鏡下觀察，是一種不破壞分生孢子結(jié)構(gòu)的快捷方法。
5、電鏡觀察 透射電鏡(TEM)用來觀察真菌的斷面，橫隔的差別、各種細(xì)胞器、細(xì)胞壁等結(jié)構(gòu)。掃描電鏡（SEM）用來觀察真菌的表面結(jié)構(gòu)，特別是產(chǎn)孢特點(diǎn)。
用表型特征對真菌進(jìn)行分類鑒定，仍然是目前臨床實(shí)驗(yàn)室普遍應(yīng)用的方法。對致病真菌的鑒定，需要選擇合適的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)后，再借助光學(xué)顯微鏡，加上熒光顯微鏡、電子顯微鏡和細(xì)胞化學(xué)等各種染色法觀察形態(tài)特點(diǎn)。
（二）分子生物學(xué)鑒定
應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)從遺傳和進(jìn)化角度闡明真菌菌種之間和種間內(nèi)在關(guān)系是目前真菌分類研究熱點(diǎn)，已普遍應(yīng)用于真菌現(xiàn)代分類鑒定之中。
常用的分子生物學(xué)鑒定方法包括：真菌DNA 鹼基組成（G+C Mol%）、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、Southern 印跡、脈沖場凝膠電泳（PFGE）、rDNA序列測定等。由于生物多樣性的緣故，分子生物學(xué)的研究有4種目的：①系統(tǒng)發(fā)生研究；②分類學(xué)研究，主要在屬、種水平；③鑒定應(yīng)用，即決定明確的分類名稱；④流行病學(xué)和群體的遺傳學(xué)研究。
DNA序列測定是目前最引人注目的發(fā)展方向，已成為致病真菌的分類鑒別的重要手段。目前應(yīng)用最多的為rDNA序列、幾丁質(zhì)合成酶、細(xì)胞色素P450 L1A1基因，細(xì)胞色素氧化酶C和細(xì)胞色素B等基因序列。
（三）生理學(xué)和生物化學(xué)方法 在純培養(yǎng)上真菌生長比較快，可以使用生理、生化方法來鑒定菌種，多用于酵母菌的鑒定。測定真菌的不同生長溫度的溫度試驗(yàn)也用于鑒定。對碳水化合物的利用能力是酵母菌鑒定的主要手段，目前已有商品化的API系統(tǒng)，也可用于絲狀真菌的輔助鑒定。
此外，微生物自動鑒定系統(tǒng)Vitek、autoSCAN-4、Biolog和MIS等自動鑒定系統(tǒng)，可以較滿意地鑒定臨床上常見的病原性酵母菌。
雖然經(jīng)典檢查方法是真菌檢查的基礎(chǔ)，雖然操作簡便但存在著敏感度低，耗時長等不足。近年來，除經(jīng)典的真菌學(xué)方法以外的非培養(yǎng)檢查方法在真菌感染診斷，特別是侵襲性真菌病方面發(fā)揮了重要作用。這些方法主要包括血清學(xué)檢查、和分子生物學(xué)檢查等。 1、血清學(xué)方法檢測真菌抗原成分
念珠菌感染和曲霉感染的血清學(xué)檢測可分為抗體檢測和抗原檢測兩大類；由于發(fā)生侵襲性真菌病的免疫受損宿主往往缺乏可檢測到的抗體，或者抗體的產(chǎn)生變化較大，因此檢測抗體對于系統(tǒng)性真菌感染的診斷意義不大，而目前用于臨床的血清學(xué)檢查主要屬于后者，即檢測血液循環(huán)中的抗原；常用的有下述幾種：
（1）、β-D-1,3葡聚糖（BDG）：是許多真菌細(xì)胞壁的主要成份，如念珠菌、曲霉、鐮刀菌等，但不包括隱球菌和接合菌；由于細(xì)菌、病毒、哺乳動物無這種成份，因而在循環(huán)血液中測得時則提示侵襲性真菌感染，目前已經(jīng)有商品化BDG檢測的試劑盒。BDG的檢測，在2小時內(nèi)可以獲得結(jié)果，因此盡管不能區(qū)分 真菌感染的種類，但是仍然具有重要作用，美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)Fungitell用于真菌感染的診斷，國內(nèi)也有相似試劑問世，目前在臨床應(yīng)用中。
（2）、半乳甘露聚糖（GM）：GM是存在于曲霉和青霉細(xì)胞壁的一種熱穩(wěn)定的多糖，可用于侵襲性曲霉病的臨床診斷?？梢允褂醚搴椭夤芊闻莨嘞匆簷z測 GM，近來也有人使用尿液和腦脊液等標(biāo)本檢測。GM檢測的敏感性為29-100%，而其特異性可超過90%。由于GM量的多少與組織中真菌含量密切相關(guān)， 因此檢測GM還可以提示疾病的預(yù)后。
2、分子生物學(xué)檢測：
由于真菌培養(yǎng)和鑒定需要的時間較長，陽性率較低，因此與分子生物學(xué)相關(guān)的從臨床標(biāo)本直接檢測真菌的技術(shù)和方法也在不斷發(fā)展中，最為活躍的當(dāng)屬PCR技術(shù)， 具有快速、敏感等特點(diǎn)。PCR技術(shù)可以擴(kuò)增血清、血漿、全血、尿液、痰液、支氣管肺泡灌洗液和膿液等標(biāo)本中的真菌成份。在進(jìn)行擴(kuò)增之前，應(yīng)當(dāng)對標(biāo)本進(jìn)行處理以去除影響擴(kuò)增效率的一些因子。所擴(kuò)增的靶序列有多種，但是應(yīng)用較多的還是 rDNA的ITS1和ITS2區(qū)域；與培養(yǎng)相比，ITS-PCR檢測血標(biāo)本中念珠菌的敏感性與特異性可以達(dá)到100%。在PCR擴(kuò)增檢測中，有傳統(tǒng)的 PCR方法，也有巢式PCR法，最近應(yīng)用較多的是實(shí)時定量PCR方法，其敏感性和特異性較好，在臨床有應(yīng)用前景！
3、真菌鏡檢
是最簡單也是很有價值的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。其優(yōu)點(diǎn)在于簡便、快速，無菌部位的陽性結(jié)果可直接確定真菌感染。但是由于陽性率較低，陰性結(jié)果亦不能排除診斷。直接鏡檢對于淺表和皮下真菌感染最有幫助。在皮膚刮屑、毛發(fā)或甲標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)皮膚癬菌、念珠菌和馬拉色菌的成分可提供對相應(yīng)真菌病的可靠診斷。如在無菌體液的 直接鏡檢中發(fā)現(xiàn)真菌成分常可確立深部真菌病的診斷，例如在腦脊液中檢測到帶莢膜的新生隱球菌酵母細(xì)胞，或外周血涂片中檢測到莢膜組織胞漿菌細(xì)胞。但一般在有菌部位則只有發(fā)現(xiàn)大量真菌菌絲方才有意義，通過直接鏡檢一般可以區(qū)分念珠菌、隱球菌、暗色真菌、毛霉（接合菌）等菌的感染，進(jìn)一步明確鑒定菌種需要通過 培養(yǎng)鑒定來完成。