中國(guó)微生物菌種查詢網(wǎng)土霉素是四環(huán)素類抗生素，能特異性地與細(xì)菌核糖體30S亞基的A位結(jié)合，抑制肽鏈的增長(zhǎng)和影響細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，對(duì)細(xì)菌有廣譜抑菌作用。因此其微生物限度檢查不能用平皿法，而應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法消除其抑菌作用后再檢查。
一、材料
1.儀器：HWS-250型恒溫恒濕箱（天津蘇瑞科技開(kāi)發(fā)有限公司），集菌儀（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司），薄膜（孔徑0．22um），康氏振蕩器。
2. 試劑：玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基，MUG培養(yǎng)基，甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基等，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。
3 .菌種：陽(yáng)性對(duì)照菌：金黃色葡萄球菌（驗(yàn)證細(xì)菌）、白色念珠菌（驗(yàn)證酵母菌、霉菌）；陰性對(duì)照：金黃色葡萄球菌（驗(yàn)證大腸埃希菌）。所用菌種均由中國(guó) 藥品生物制品檢定所提供；稀釋劑及沖洗劑為pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液。
4 .樣品：土霉素片［0.25g（25萬(wàn)單位）］，廠家為河南華利藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)為07070601。
二、方法與結(jié)果
1 .細(xì)菌、霉菌、酵母菌檢查方法驗(yàn)證。
2. 細(xì)菌檢測(cè)方法驗(yàn)證。
試驗(yàn)組：取供試品10g，加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，于康氏振蕩器上振搖10分鐘，使片分散，500轉(zhuǎn)、分離心后，分離上清液作為供試液。取上述供試液10ml，加入100ml稀釋劑中，薄膜過(guò)濾，用沖洗液沖洗2次，每次100ml，第3次沖洗液中加入金黃色葡萄球菌菌懸液0.5ml，薄膜過(guò)濾，取出濾膜，面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上，35℃培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)。
菌液組：取金黃色葡萄球菌菌懸液0.5ml,直接接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上，35℃培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)。
供試品對(duì)照組：取上述供試液10ml,加入100ml稀釋劑中，薄膜過(guò)濾，用沖洗液沖洗3次，每次100ml，取出濾膜，面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上，35℃培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)。
稀釋劑對(duì)照組：取稀釋液10ml,薄膜過(guò)濾，用沖洗液沖洗2次，每次100ml,第3次沖洗液中加入0.5ml金黃色葡萄球菌菌懸液，薄膜過(guò)濾，取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上，35℃培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)。
上述試驗(yàn)連續(xù)做三次，結(jié)果如下：?
金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)后平均值：?
稀釋劑對(duì)照組菌數(shù)：第一次47個(gè)，第二次53個(gè)，第三次49個(gè)；?
菌液組菌數(shù)：第一次58個(gè)，第二次64個(gè)，第三次60個(gè)；?
試驗(yàn)組菌數(shù)：第一次45個(gè)，第二次54個(gè)，第三次46個(gè)；?
供試品對(duì)照組菌數(shù)：第一次0個(gè)，第二次0個(gè)，第三次0個(gè)。
計(jì)算金黃色葡萄球菌回收率。
1 、稀釋劑對(duì)照組的回收率:(稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)/菌液組的平均菌落數(shù))×100%?
第一次：47/58×100%=81.0%
第二次: 53/64×100%=82.8%?
第三次: 49/60×100%=81.7%
2 、試驗(yàn)組的回收率:?
[(試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)]×100%?
第一次：（45-0）/58×100%=77.6%?
第二次:（54-0）/64×100%=84.4%?
第三次:（46-0）/60×100%=76.7%
霉菌、酵母菌檢查方法驗(yàn)證。
試驗(yàn)組：取供試品10g，加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，于康氏振蕩器上振搖10分鐘，使片分散，500轉(zhuǎn)、分離心后，分離上清液作為供試液。取上述供試液10ml，加入100ml稀釋劑中，薄膜過(guò)濾，用沖洗液沖洗2次，每次100ml，第3次沖洗液中加入白色念珠菌菌懸液0.5ml，薄膜過(guò)濾，取出濾膜，面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上，23℃培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)數(shù)。
菌液組：取白色念珠菌菌懸液0.5ml,直接接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上，23℃培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)數(shù)。
供試品對(duì)照組：取上述供試液10ml,加入100ml稀釋劑中，薄膜過(guò)濾，用沖洗液沖洗3次，每次100ml，取出濾膜，面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上，23℃培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)數(shù)。
稀釋劑對(duì)照組：取稀釋液10ml,薄膜過(guò)濾，用沖洗液沖洗2次，每次100ml,第三次沖洗液中加入0.5ml白色念珠菌菌懸液，薄膜過(guò)濾，取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上，23℃培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)數(shù)。
上述試驗(yàn)連續(xù)做三次，結(jié)果如下：?
白色念珠菌計(jì)數(shù)后平均值：?
稀釋劑對(duì)照組菌數(shù)：第一次56個(gè)，第二次60個(gè)，第三次53個(gè)；?
菌液組菌數(shù)：第一次45個(gè)，第二次47個(gè)，第三次42個(gè)；?
試驗(yàn)組菌數(shù)：第一次43個(gè)，第二次45個(gè)，第三次44個(gè)；?
供試品對(duì)照組菌數(shù)：第一次0個(gè)，第二次0個(gè)，第三次0個(gè)。
2.1.2.6 計(jì)算白色念珠菌的回收率。
2.1.2.6.1 稀釋劑對(duì)照組的回收率:
(稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)/菌液組的平均菌落數(shù))×100%?
第一次：45/56×100%=80.4%?
第二次: 47/60×100%=78.3%?
第三次: 42/53×100%=78.2%
2.1.2.6.2 試驗(yàn)組的回收率:
[(試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)]×100%?
第一次：（43-0）/56×100%=76.8%?
第二次:（45-0）/60×100%=75.0%?
第三次:（44-0）/53×100%=83.0%
2.2 大腸埃希菌檢測(cè)方法驗(yàn)證。
2.2.1 試驗(yàn)組：取供試品10g，加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，于康氏振蕩器上振搖10分鐘，使片分散，500轉(zhuǎn)/分離心后，分離上清液作為供試液。取上述供試液10ml，加入100ml稀釋劑中，薄膜過(guò)濾，用沖洗液沖洗2次，每次100ml，第三次沖洗液中加入大腸埃希菌菌懸液0.2ml，薄膜過(guò)濾，取出濾膜，放入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中, 35℃培養(yǎng)24小時(shí),取0.2ml上述培養(yǎng)物加入5ml MUG培養(yǎng)基中,24小時(shí)后,加靛基質(zhì)試液5滴,液面呈現(xiàn)玫瑰紅環(huán)。
2.2.2 陰性菌對(duì)照組：照上述方法操作，第三次沖洗時(shí)沖洗液中加入2ml金黃色葡萄球菌菌液，薄膜過(guò)濾，取出濾膜加入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)24小時(shí)，再取上述培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，于35℃培養(yǎng)24小時(shí)，未發(fā)現(xiàn)有金黃色葡萄球菌典型菌落。
3 討論
3.1 在細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證三次平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照菌回收率均不低于70%，試驗(yàn)組的菌回收率均不低于70%，照薄膜過(guò)濾法可進(jìn)行土霉素片的細(xì)菌、霉菌及酵母菌的檢查。
3.2 通過(guò)大腸埃希菌檢測(cè)方法驗(yàn)證，陰性對(duì)照組未檢出金黃色葡萄球菌，試驗(yàn)組檢出大腸埃希菌，按薄膜過(guò)濾法可進(jìn)行土霉素片的大腸埃希菌檢查。