細(xì)胞冷凍與復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)工作，可以解決細(xì)胞因?yàn)檫B續(xù)繼代造成的退變或轉(zhuǎn)化。細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)以及細(xì)胞凍存和復(fù)蘇后都需要細(xì)胞計(jì)數(shù)。那么細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活的測(cè)試實(shí)驗(yàn)方法有哪些呢？
1、原理：
?。?）計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤或是Coultercounter粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。
?。?）血球計(jì)數(shù)盤一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1mm2大正方形，其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格，深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目。
?。?）存活測(cè)試之步驟為dyeexclusion，利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無法滲入而不會(huì)呈色。一般使用藍(lán)色之trypanblue染料，如果細(xì)胞不易吸收trypanblue，則用紅色之Erythrosinbluish。計(jì)算細(xì)胞活率：活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）×100%。計(jì)數(shù)應(yīng)在臺(tái)盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成，隨時(shí)間延長(zhǎng)，部分活細(xì)胞也開始攝取染料；因?yàn)榕_(tái)盼蘭對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確。
2、材料：
0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)；Erythosinbluishstain；取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及0.05grampreservativemethylparaben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球計(jì)數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip)；計(jì)數(shù)器(counter)；低倍倒立顯微鏡；粒子計(jì)數(shù)器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白細(xì)胞稀釋液（4%乙酸溶液）。
3、步驟：
?。?）取50μl細(xì)胞懸浮液與50μltrypanblue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。
?。?）取少許混合液(約15μl)自血球計(jì)數(shù)盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞則為藍(lán)色(或紅色-Erythrosinbluish)。
（3）計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之細(xì)胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypanblue等體積混合)，最后乘以104，即為每ml中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線上，只計(jì)上線與右線之細(xì)胞(或計(jì)下線與左線之細(xì)胞)。
注：4大格細(xì)胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×104/4=細(xì)胞數(shù)/ml；每一大格的體積=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，最適濃度為5～10×105細(xì)胞/ml，此范圍外計(jì)數(shù)誤差偏大。高濃度細(xì)胞懸液，可取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計(jì)數(shù)。
5、范例：
T75monolayerculture制成10ml細(xì)胞懸浮液，取0.1ml溶液與0.1mltrypanblue混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計(jì)數(shù)盤，計(jì)數(shù)四大方格內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目。
活細(xì)胞數(shù)/方格：55，62，49，59；死細(xì)胞數(shù)/方格：5，3，4，6；細(xì)胞總數(shù)=243
平均細(xì)胞數(shù)/方格=60.75；稀釋倍數(shù)=2；
細(xì)胞數(shù)/ml：60.75×104×2（稀釋倍數(shù)）=1.22×106；
細(xì)胞數(shù)/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106
存活率：225/243﹦92.6%