雙歧桿菌是專性厭氧菌，對氧氣非常敏感，因此，雙歧桿菌的分離、培養(yǎng)及活菌計(jì)數(shù)的關(guān)鍵是提供無氧和低氧化還原電勢的培養(yǎng)環(huán)境。
雙歧桿菌的最適生長溫度37℃~41℃，最低生長溫度25℃~28℃，最高43℃~45℃。初始最適pH 6.5~7.0，在pH4.5~5.0或pH 8.0~8.5不生長。其細(xì)胞呈現(xiàn)多樣形態(tài)，有短桿較規(guī)則形、纖細(xì)桿狀具有尖細(xì)末端形、球形、長桿彎曲形、分枝或分叉形、棍棒狀或匙形。單個或鏈狀、V形、柵欄狀排列，或聚集成星狀。革蘭氏陽性，不抗酸，不形成芽孢，不運(yùn)動。雙歧桿菌的菌落光滑、凸圓、邊緣完整、乳脂至白色、閃光并具有柔軟的質(zhì)地。雙歧桿菌是人體內(nèi)的正常生理性細(xì)菌，定殖于腸道內(nèi)，是腸道的優(yōu)勢菌群，占嬰兒消化道菌叢的92%。該菌與人體終生相伴，其數(shù)量的多少與人體健康密切相關(guān)，是目前公認(rèn)的一類對機(jī)體健康有促進(jìn)作用的代表性有益菌。該菌可以在腸粘膜表面形成一個生理性屏障，從而抵御傷寒沙門氏菌、致瀉性大腸桿菌，痢疾致賀氏菌等病原菌的侵襲，保持機(jī)體腸道內(nèi)正常的微生態(tài)平衡；能激活巨噬細(xì)胞的活性，增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞的免疫力；能合成B族維生素、煙酸和葉酸等多種維生素；能控制內(nèi)毒素血癥和防治便秘，預(yù)防貧血和佝僂病；可降低亞硝胺等致癌物前體的形成，有防癌和抗癌作用；能拮抗自由基、羥自由基及脂質(zhì)過氧化，具有抗衰老功能。
雙歧桿菌的培養(yǎng)方法很多，如厭氧箱法、厭氧袋法、厭氧罐法。本實(shí)驗(yàn)介紹的是一種簡便的試管培養(yǎng)法——亨蓋特厭氧滾管技術(shù)該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是：預(yù)還原培養(yǎng)基制好后，可隨時取用進(jìn)行試驗(yàn)；任何時間觀察或檢查試管內(nèi)的菌都不會干擾厭氧條件。
近年來興起的一種新的RAPD等分子生物學(xué)技術(shù)對雙歧桿菌進(jìn)行基因指紋圖譜的構(gòu)建，分析不同雙歧桿菌種間存在的同源性和多態(tài)性；RAPD技術(shù)也可用于雙歧桿菌菌種鑒定及分型。一般來講，我們都應(yīng)用適合鑒定所有厭氧菌的方法，主要包括雙歧桿菌特定酶的檢測、乙酸、乳酸等有機(jī)酸的測定、糖發(fā)酵試驗(yàn)和其他相關(guān)指標(biāo)等。
一、實(shí)驗(yàn)方法
1、銅柱系統(tǒng)除氧
2、預(yù)還原培養(yǎng)基及稀釋液的制備
制作預(yù)還原培養(yǎng)基及稀釋液時，先將配置好的培養(yǎng)基和稀釋液煮沸驅(qū)氧，而后用半定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中，一般瓊脂培養(yǎng)基裝4.5～5.0mL，稀釋液裝9mL，并插入通N2氣的長針頭以排除O2。此時可以清楚的看到培養(yǎng)基內(nèi)加入的氧化還原指示劑—刃天青由藍(lán)到紅最后變成無色，說明試管內(nèi)已成為無氧狀態(tài)，然后蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋，滅菌備用。
3、分離
（1）編號
取五支無菌水試管，分別用記號筆標(biāo)明10-1、10-2……10-5。
（2）稀釋
在無菌條件下，用無菌注射器吸取1mL混合均勻的液體樣品，加入裝有預(yù)還原生理鹽水的厭氧試管中，用震蕩器將其混合均勻，制成10-1稀釋液。用無菌注射器吸取1mL10-1稀釋液至另一裝有9mL生理鹽水的厭氧試管中，制成10-2稀釋液。依此進(jìn)行10倍系列稀釋，至10-7，制成不同樣品稀釋液。通常選10-5、10-6、10-7三個稀釋度進(jìn)行滾管計(jì)數(shù)。
（3）滾管分離
1）滾管
將無氧無菌的瓊脂培養(yǎng)基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒溫的水浴中，待用，用無菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三個稀釋度各0 .1mL，分別注入待用的試管中，然后將其平放于盛有冰水的瓷盤中迅速滾動，帶菌的溶化瓊脂在試管內(nèi)壁會即刻形成凝固層。
2）分離
生成的菌落需挑取出來，鏡檢其形態(tài)及純度。如尚未獲得純培養(yǎng)物，需再次稀釋滾管，并再次挑取菌落，直至獲得純培養(yǎng)物為止。待挑取的單菌落預(yù)先在放大鏡下觀察確定，做好標(biāo)記。然后將培養(yǎng)基試管固定于適當(dāng)?shù)闹Ъ苌?，打開試管膠塞，同時迅速將氣流適當(dāng)、火焰滅過菌的氮?dú)忾L針頭插入管內(nèi)。同時，另一液體厭氧管去掉膠塞插入另一滅過菌的通氣針頭。將準(zhǔn)備好的彎頭毛細(xì)管小心插入固體培養(yǎng)基內(nèi)，找準(zhǔn)待挑菌落，輕輕吸取，轉(zhuǎn)移至液體試管內(nèi)，加塞。37℃培養(yǎng)。培養(yǎng)24h或待培養(yǎng)液混濁后檢查已分離培養(yǎng)物的純度。
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