一，細(xì)胞培養(yǎng)基的選擇
（1）根據(jù)細(xì)胞特點(diǎn)、蛋白表達(dá)及病毒特點(diǎn)和培養(yǎng)方式選擇細(xì)胞培養(yǎng)基
商售工業(yè)用細(xì)胞培養(yǎng)基主要是干粉培養(yǎng)基，常用的培養(yǎng)基主要包括199、MEM、RPMI-1640、DMEM、DMEM/F12等系列，根據(jù)細(xì)胞的特性及工業(yè)化的生產(chǎn)需求，開發(fā)或生產(chǎn)的同一系列的細(xì)胞培養(yǎng)基在成份上也有一定的變化，如MEM細(xì)胞培養(yǎng)基有含Earle's平衡鹽的類型，也有含Hanks'平衡鹽的類型；依據(jù)除菌方式又可分為高壓滅菌型和過濾除菌型；還有含非必需氨基酸的類型，及是否含有酚紅等；DMEM培養(yǎng)基分為高糖型和低糖型，據(jù)此結(jié)合實(shí)際培養(yǎng)的細(xì)胞特點(diǎn)、產(chǎn)品特點(diǎn)及生產(chǎn)工藝等進(jìn)行選擇和優(yōu)化，最終選擇的培養(yǎng)基需要達(dá)到以下目標(biāo)：
1.提高細(xì)胞密度和細(xì)胞活力；
2.提高單位體積培養(yǎng)液中病毒量或抗體表達(dá)量，提高生產(chǎn)效率；
3.降低動物來源成份，簡化純化成本，提高生物制品的安全性。
不同的細(xì)胞株甚至同一細(xì)胞株在不同的培養(yǎng)條件下都有著不同的營養(yǎng)需求，細(xì)胞作為病毒等繁殖的宿主，為細(xì)胞株選用合適的培養(yǎng)基，使細(xì)胞保持快速增殖和高活率狀態(tài)，才能夠提高生物制品的產(chǎn)率。在選用合適的細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)可根據(jù)以下幾種方法進(jìn)行：
可從細(xì)胞系最初建系用培養(yǎng)基，也可從細(xì)胞的來源處獲得，細(xì)胞庫（如ATCC、ECACC）可以提供常用細(xì)胞系所用培養(yǎng)基的信息。但該種細(xì)胞培養(yǎng)基通常選擇的是最基礎(chǔ)的培養(yǎng)基。
1.還可用多種細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，可用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁鎖。
2.也可根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室慣用的細(xì)胞培養(yǎng)基，許多培養(yǎng)基可以適合于多種細(xì)胞，通過幾種培養(yǎng)基的選擇測試進(jìn)行挑選，亦可參考一些經(jīng)驗(yàn)（見表6-1），縮小選擇的范圍。
3.針對細(xì)胞特點(diǎn)及培養(yǎng)工藝需要。
培養(yǎng)細(xì)胞的目的是使其表達(dá)生產(chǎn)相應(yīng)的目的物，因此，在滿足細(xì)胞生長增殖的基礎(chǔ)上，細(xì)胞培養(yǎng)基的開發(fā)還應(yīng)滿足病毒等在細(xì)胞中的高表達(dá)及性能穩(wěn)定性。同一株細(xì)胞可以作為幾種生物制品的生產(chǎn)平臺（如上表中所列）、同一病毒液可在幾種宿主細(xì)胞中表達(dá)，因此，選擇最優(yōu)化的宿主細(xì)胞及最高產(chǎn)品表達(dá)量是生物制品廠家追求的一個(gè)目標(biāo)，而相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)基的正確選擇是促使目標(biāo)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要影響因素。LONZA公司2005年【12】研究結(jié)果表明，同一細(xì)胞株，采用優(yōu)化后的限定化學(xué)成份細(xì)胞培養(yǎng)基與傳統(tǒng)的合成細(xì)胞培養(yǎng)基相比，蛋白表達(dá)量提高了9.6倍，從該結(jié)果可以看到細(xì)胞培養(yǎng)基的選擇和優(yōu)化對于提高產(chǎn)物表達(dá)量的重要性。
生產(chǎn)工藝的革新或改進(jìn)是提高生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本的一個(gè)有效途徑，相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)基的支持顯得較為重要。如由轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)換為生物反應(yīng)器培養(yǎng)時(shí)，傳統(tǒng)的合成細(xì)胞培養(yǎng)基較難滿足生物反應(yīng)器中細(xì)胞的高密度生長、抗剪切力、降低表面張力等需要，則需要更換相應(yīng)的懸浮培養(yǎng)用細(xì)胞培養(yǎng)基滿足上述需求。在有血清懸浮培養(yǎng)轉(zhuǎn)至無血清懸浮培養(yǎng)時(shí)，缺少了血清的保護(hù)和促增殖作用，相應(yīng)無血清培養(yǎng)基的支撐顯得更為重要。
隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及基因工程技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞株的改造和馴化技術(shù)提高，高表達(dá)細(xì)胞株或是懸浮細(xì)胞株（貼壁細(xì)胞懸浮化培養(yǎng)等）的構(gòu)建、馴化，如細(xì)胞由貼壁培養(yǎng)狀態(tài)向懸浮培養(yǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)換時(shí)，或是在有血清懸浮培養(yǎng)轉(zhuǎn)至無血清懸浮培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞的代謝狀況可能發(fā)生改變，傳統(tǒng)用細(xì)胞培養(yǎng)基可能不能適應(yīng)改造后或是馴化后細(xì)胞株的生長增殖需求，相應(yīng)個(gè)性化細(xì)胞培養(yǎng)基的支撐顯得更為重要。相應(yīng)個(gè)性化細(xì)胞培養(yǎng)基的支撐顯得更為重要。這些個(gè)性化細(xì)胞培養(yǎng)基或是直接來自細(xì)胞培養(yǎng)基生產(chǎn)廠家的革新、或是與使用者共同開發(fā)定制的專業(yè)化細(xì)胞培養(yǎng)基。
（2）選擇高品質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)基
細(xì)胞培養(yǎng)基作為原材料直接影響生物制品的質(zhì)量。無論是國產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)基還是進(jìn)口細(xì)胞培養(yǎng)基，由于國內(nèi)目前還無明確的法律法規(guī)來規(guī)范細(xì)胞培養(yǎng)基的產(chǎn)、銷過程，各企業(yè)執(zhí)行各自的生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品配方，由于信息的不對稱，細(xì)胞培養(yǎng)基生產(chǎn)企業(yè)存在的諸多問題，尤其是安全性問題并不能被用戶所了解。生物制品生產(chǎn)企業(yè)需篩選真正符合生物制品原材料質(zhì)量要求的培養(yǎng)基，從源頭上控制好生物制品的安全風(fēng)險(xiǎn)，需建立基本的產(chǎn)品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，尤其在沒有統(tǒng)一法規(guī)、行規(guī)的條件之下，只能通過挑選合格的供應(yīng)商、自身建立一套質(zhì)量檢驗(yàn)體系，對每批產(chǎn)品進(jìn)行檢驗(yàn)等確保培養(yǎng)基的質(zhì)量。
（3）從經(jīng)濟(jì)性、安全性角度選擇合適的細(xì)胞培養(yǎng)基
隨著生物制品安全性要求的提高，細(xì)胞培養(yǎng)基作為生物制品的一個(gè)重要原材料，直接影響其產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性。當(dāng)前，基于人、蓄安全性角度考慮，國外許多法規(guī)要求采用不含動物組份的細(xì)胞培養(yǎng)基，無動物來源成份的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基將是生物制品企業(yè)選擇的趨勢所在。
除滿足安全性需求外，選擇細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)價(jià)格也是不得不考慮的一個(gè)因素。工業(yè)化通常直接購買供應(yīng)商的干粉細(xì)胞培養(yǎng)基，有些培養(yǎng)基可能需要添加谷氨酰胺，大部分基礎(chǔ)合成細(xì)胞培養(yǎng)基中需要添加一些血清。隨著對生物制品安全性要求的提高，并滿足生物制品體外生產(chǎn)時(shí)需要去除動物蛋白的要求，針對一些連續(xù)細(xì)胞系，設(shè)計(jì)了個(gè)性化的低血清細(xì)胞培養(yǎng)基及無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，雖然這些培養(yǎng)基的價(jià)格較為昂貴，但相比血清給后期純化及產(chǎn)品質(zhì)量帶來的影響，這些培養(yǎng)基生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量和安全性明顯較高，相應(yīng)產(chǎn)品的市場競爭力增強(qiáng)、市場占有率提升，企業(yè)的最終的生產(chǎn)效益提高。
（4）供應(yīng)商的選擇
選擇細(xì)胞培養(yǎng)基的同時(shí)也需考核、選擇供應(yīng)商。
目前，國內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)基行業(yè)管理存在缺失現(xiàn)象，國內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)基行業(yè)沒有統(tǒng)一的生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范。生物制品企業(yè)除自身建立一套質(zhì)量檢驗(yàn)體系外，挑選合格的細(xì)胞培養(yǎng)基供應(yīng)商是進(jìn)行原材料質(zhì)量控制的另一種重要的方法。選擇供應(yīng)商時(shí)可通過對比細(xì)胞培養(yǎng)基生產(chǎn)企業(yè)在硬件和軟件上的情況和差距，對細(xì)胞培養(yǎng)基的原材料、生產(chǎn)過程、生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)用設(shè)備、應(yīng)用性檢測、安全性檢測等方面檢查并評估供應(yīng)商的生產(chǎn)、質(zhì)控能力。
國產(chǎn)與進(jìn)口細(xì)胞培養(yǎng)基的生產(chǎn)及銷售渠道可能會有一定差別，進(jìn)口產(chǎn)品供貨周期有一定限制，在國產(chǎn)和進(jìn)口培養(yǎng)基均能夠滿足生物制品廠家要求的時(shí)候，國產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)基相應(yīng)是較好的選擇，原因主要包括兩個(gè)方面，一方面國產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)基在價(jià)格上存在優(yōu)勢，生產(chǎn)同樣的產(chǎn)品，與國內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)基廠家相比，技術(shù)水平和可信度較高的國外細(xì)胞培養(yǎng)基廠家通常整體規(guī)模較大，相應(yīng)的產(chǎn)品生產(chǎn)及運(yùn)營費(fèi)用較高，導(dǎo)致產(chǎn)品價(jià)格昂貴；另一方面，細(xì)胞培養(yǎng)基使用廠家可直接考核國內(nèi)供應(yīng)商，易于使用廠家控制細(xì)胞培養(yǎng)基的質(zhì)量，并更易獲得產(chǎn)品性能相關(guān)的技術(shù)支持及售后技術(shù)服務(wù)。
二，細(xì)胞培養(yǎng)基的配制和滅菌
細(xì)胞培養(yǎng)基的種類不同，其使用上可能會有一定的差異，因此正確的配制細(xì)胞培養(yǎng)基是使其被充分利用的前提。
（1）培養(yǎng)基配制準(zhǔn)備工作
物品準(zhǔn)備、器皿清潔（物理、化學(xué)及生物清潔）符合GMP要求，最終目的是保證細(xì)胞培養(yǎng)基的純度：避免混入抑制物、有毒物質(zhì)及減少微生物污染的機(jī)會。
配制前需要確保設(shè)備及儀器正常運(yùn)轉(zhuǎn)，通常所用的設(shè)備或儀器主要包括：
1) 超凈工作間或超凈工作臺：可根據(jù)自身?xiàng)l件或建立設(shè)施完備的萬級、千級、百級等超凈工作環(huán)境。
2) 烤箱：烘烤玻璃器皿、去除熱原。
3) 高壓蒸汽滅菌鍋
4) 恒溫培養(yǎng)箱：用于檢測過濾后的細(xì)胞培養(yǎng)基中是否還含有細(xì)菌的檢測。
5) 過濾器：不銹鋼濾器或一次性膜過濾器。
6) 儀器：天平，pH 計(jì)，滲透壓儀，正壓、負(fù)壓蠕動泵或吸引器，純水設(shè)備。
由于使用或配制量不同，在設(shè)備或儀器的規(guī)格上可能會有出入，但需確保所有的設(shè)備和儀器需按GMP等相關(guān)規(guī)定進(jìn)行驗(yàn)證，其中，配液用水管路出水口所出水每天需進(jìn)行檢測；不銹鋼過濾器每次使用前和使用后需進(jìn)行無菌驗(yàn)證，驗(yàn)證合格方可使用。
（2）干粉細(xì)胞培養(yǎng)基的配制方式及注意事項(xiàng)
在細(xì)胞培養(yǎng)基配制過程中，不同的培養(yǎng)基其溶解性可能有一定的差別，培養(yǎng)基配制過程中血清、碳酸氫鈉及抗生素等的添加時(shí)間和用量、pH和滲透壓的測定及酸堿度是否需要調(diào)節(jié)等，都可能影響最終細(xì)胞培養(yǎng)基性能的發(fā)揮。
a,配制常規(guī)過濾除菌粉末細(xì)胞培養(yǎng)基
1) 配制用水：通常選擇最新制備的超純水器過濾出的去熱原（細(xì)菌內(nèi)毒素<0.25EU/m）培養(yǎng)基用水（TOC< 10μg/L或者是10mg/L，電阻率：18.2MΩ（25℃））。最好現(xiàn)用現(xiàn)制備，隔夜儲存用水（非無菌）的細(xì)菌內(nèi)毒素及電導(dǎo)率等升高，影響細(xì)胞的增殖和產(chǎn)品的質(zhì)量；
2) 培養(yǎng)基粉劑的稱量：小量采用天平稱量，要求準(zhǔn)確；大量采用市售大包裝，配制時(shí)可以根據(jù)說明；
3) 粉劑溶解：溶解充分，觀察有無顆粒，顏色改變情況等；
4) 過濾前約半個(gè)小時(shí)（根據(jù)配制量可調(diào)）按使用說明添加NaHCO3，充分溶解；
5) 測定pH，根據(jù)需要用1mol / L 氫氧化鈉溶液或 1mol /L鹽酸溶液來調(diào)節(jié)pH。過濾后的pH將會有所增長；
6) 定容，檢測滲透壓；
7) 盡快過濾、分裝，封好瓶口，避免漏氣，2~8℃保存；
8) 采用一次性濾器時(shí)濾后檢查濾膜，有無漏、裂、是否很臟或是有未溶解物；采用不銹鋼濾器（內(nèi)置可反復(fù)用的除菌濾芯）需進(jìn)行濾器的完成性檢測；
9) 過濾前、中、后三段采樣進(jìn)行無菌檢測，同時(shí)，留取樣品置于37℃培養(yǎng)，至該批培養(yǎng)基用完；
10) 完整記錄整個(gè)過程每一個(gè)步驟，便于追溯。
新購細(xì)胞培養(yǎng)基或是新批次的細(xì)胞培養(yǎng)基，需小劑量配制，進(jìn)行細(xì)胞適應(yīng)試驗(yàn)，結(jié)果驗(yàn)證可用后，方可進(jìn)行大規(guī)模配制。
b,配制可高壓滅菌粉末細(xì)胞培養(yǎng)基
1) 其配制用水及配制粉劑的稱取、及配制程序基本同過濾型培養(yǎng)基配制方法。溶解后高壓，通常在121℃、15psi下滅菌15分鐘。
2) 待細(xì)胞培養(yǎng)液冷卻至室溫，按一定比例加入無菌的谷氨酰胺溶液、無菌7.5％（w/v）碳酸氫鈉溶液，加注射用水（水溫20℃～30℃）至規(guī)定體積，混勻。
3) 如果必要，用1mol / L 氫氧化鈉溶液或 1mol /L鹽酸溶液調(diào)pH至所需值。
4) 溶液應(yīng)在2℃－8℃下避光保存。
目前國內(nèi)工業(yè)化用細(xì)胞培養(yǎng)基主要為干粉型?？紤]水質(zhì)量對細(xì)胞培養(yǎng)液的影響以及使用方便，國外實(shí)驗(yàn)室和部分工業(yè)生物制藥企業(yè)開始使用一次性袋子包裝的液體細(xì)胞培養(yǎng)液。鑒于目前運(yùn)輸成本，我們國內(nèi)生物制藥企業(yè)基本都采用干粉型細(xì)胞培養(yǎng)基，配制培養(yǎng)基要注意以下幾個(gè)共同問題：
1) 培養(yǎng)基配制用水的品質(zhì)控制非常重要。
2) 在配制或使用過程中應(yīng)注意配置說明，不可隨意濃縮，因?yàn)椴煌煞莸娜芙庑圆煌?，如葉酸在濃縮的儲存液中會產(chǎn)生沉淀。
3) 產(chǎn)品說明書中都注明干粉細(xì)胞培養(yǎng)基中不包含的成份，常見的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES、酚紅等。這些成份中有些是必須加，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些則要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要來決定。
4) 配制時(shí)要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要在培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。
5) 所用器皿應(yīng)十分潔凈。
6) 配制好的細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)馬上過濾，無菌保存于2℃－8℃。
c,不同細(xì)胞培養(yǎng)基的除菌方式及注意事項(xiàng)
細(xì)胞培養(yǎng)基滅菌的方式分為高壓滅菌和膜過濾除菌，不同的培養(yǎng)基由于其營養(yǎng)成份不同，滅菌方式也可能不同。
絕大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基不適宜高壓滅菌。因?yàn)楦邏簻缇灼茐募?xì)胞培養(yǎng)基中的一些成份，如某些維生素等，因此，在通常的高壓滅菌型細(xì)胞培養(yǎng)基中，配方中的維生素種類與過濾型培養(yǎng)基相比較少，對于細(xì)胞生長不可或缺的谷氨酰胺等，需待高壓后補(bǔ)充到培養(yǎng)基中。在高壓過程中，滅菌用器皿的選擇應(yīng)注意避免蒸發(fā)或是污染。在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中，可以采用短時(shí)超高溫處理的方法進(jìn)行流水線式的滅菌，能夠提高自動化生產(chǎn)效率，降低成本。
膜過濾除菌是當(dāng)前較為常用及便捷的一種方法，常采用0.2μm孔徑的濾膜，部份采用0.1μm孔徑，與高壓過濾方式相比，雖然濾膜具有使用期限且價(jià)格較高，但對細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成份破壞性較小。
d,不同細(xì)胞培養(yǎng)基存儲過程中的注意事項(xiàng)
通常液體細(xì)胞培養(yǎng)基避免- 20 ℃凍存，因?yàn)榻鈨鰰r(shí)可能會有營養(yǎng)成份析出，影響培養(yǎng)效果；正常情況下于2℃~8℃避光保存，使用前從冰箱取出，放入室溫進(jìn)行平衡。通常的液體培養(yǎng)基有效期是6個(gè)月到12個(gè)月。液體細(xì)胞培養(yǎng)基盡量避免長期貯存，其中的谷氨酰胺會隨著儲存時(shí)間的延長而慢慢分解，如果細(xì)胞生長不良，可考慮檢測培養(yǎng)基中的谷氨酰胺含量確定是否再補(bǔ)加谷氨酰胺。市售商業(yè)化液體細(xì)胞培養(yǎng)基有具體的有效期，對于使用干粉細(xì)胞培養(yǎng)基自行配制成液體以后，也應(yīng)低溫（2℃~8℃）貯存，除培養(yǎng)基中如谷氨酰胺易降解之外，培養(yǎng)基中的其他成份隨著溫度的升高也可能會發(fā)生降解或是析出。
在國內(nèi)傳統(tǒng)的生物制品生產(chǎn)過程中，配制的細(xì)胞培養(yǎng)基過濾后用轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行分裝，為防止液體過濾及分裝時(shí)可能存在的污染性問題，常采用配制后于37℃擱置一段時(shí)間（7~14天），無菌方敢使用，但是對比試驗(yàn)顯示，低溫貯存的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞的效果好于37℃存貯，通常對于過濾設(shè)備的驗(yàn)證合格后，過濾過程中間隔取樣進(jìn)行無菌驗(yàn)證即可；并且大批量長時(shí)間的高溫貯存除可能對營養(yǎng)成份造成降解外，場地及高溫的保持也造成了生產(chǎn)成本的提高。目前，對于一些較大規(guī)模的生物制品廠家，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)管道化配制、使用，污染的安全性明顯降低。
工業(yè)化生產(chǎn)中通常采購干粉細(xì)胞培養(yǎng)基，與液體培養(yǎng)基相比，存儲方便且價(jià)格便宜，干粉細(xì)胞培養(yǎng)也應(yīng)長期貯存在2~8℃，尤其是對于一些營養(yǎng)豐富的低血清和無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，成份復(fù)雜且含量較高，有些成分的溶解性較低，生產(chǎn)過程中采用特殊的加工工藝提高其溶解性的同時(shí)，如果長期的高溫或極端低溫條件，也有可能改變其理化性質(zhì)，在購買或是使用過程中，須嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行存儲。
三，細(xì)胞培養(yǎng)基使用過程中常見問題分析
（1）細(xì)胞培養(yǎng)基的緩沖系統(tǒng)選擇及pH變化問題
由于大多數(shù)細(xì)胞適宜的pH為7.0~7.4，偏離此范圍可能對細(xì)胞生長將產(chǎn)生有害的影響。但各種細(xì)胞對pH的要求也不完全相同，原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般對pH變動耐受力差，無限細(xì)胞系耐受力強(qiáng)。因此，原代培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)液中的緩沖系統(tǒng)就顯得較為重要。一般的細(xì)胞培養(yǎng)基采用的都是平衡鹽系統(tǒng)，但不同的培養(yǎng)基或是同一系列的培養(yǎng)基所用平衡鹽系統(tǒng)不同，如199系列培養(yǎng)基、MEM系列培養(yǎng)基均有Hanks′系統(tǒng)的培養(yǎng)基及Earle′s系統(tǒng)的培養(yǎng)基。但是有些培養(yǎng)基不是上述常規(guī)的平衡鹽系統(tǒng)，例如RPMI1640培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基。MEM低血清培養(yǎng)基的平衡鹽系統(tǒng)也不是常規(guī)的平衡鹽系統(tǒng)，該平衡鹽系統(tǒng)的緩沖能力強(qiáng)于常規(guī)平衡鹽系統(tǒng)的緩沖能力，選擇合適的緩沖系統(tǒng)具有重要的作用。
在配制細(xì)胞培養(yǎng)液時(shí)，新配制的培養(yǎng)基在經(jīng)過0.10um或0.22um濾膜過濾時(shí)，溶液的pH會向上浮動0.2左右。
細(xì)胞培養(yǎng)過程中pH值下降產(chǎn)生的原因較多。在細(xì)胞生長非?？鞎r(shí)，pH值通常下降得很快，此時(shí)可以通過及時(shí)傳代、提高傳代比例或降低血清量等方法進(jìn)行解決。此外，培養(yǎng)瓶蓋擰得過緊、NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖能力不夠、培養(yǎng)液中鹽濃度不正確、細(xì)菌、酵母或真菌污染等也能導(dǎo)致pH值通常下降得很快。這時(shí)，可以通過以下幾種方法解決：
1) 按培養(yǎng)液中NaHCO3濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度，NaHCO3含量在2.0g/L到3.7g/L之間時(shí)對應(yīng)的CO2濃度為5％到10％；
2) 改用不依賴CO2培養(yǎng)液；
3) 松開瓶蓋1/4 圈。在培養(yǎng)液加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度；
4) 在CO2培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle′s鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks′鹽配制的培養(yǎng)液；
5) 如果是污染造成的則丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌。
（2）細(xì)胞培養(yǎng)基常用幾種重要的添加成份及使用過程中應(yīng)注意的問題
酚紅在細(xì)胞培養(yǎng)基中用作pH值的指示劑，一般情況下，可以通過酚紅的指示作用判斷培養(yǎng)基的pH值，中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色；但低血清或是無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中酚紅的含量與普通細(xì)胞培養(yǎng)基中的酚紅含量不同，不能通過肉眼觀察或通過經(jīng)驗(yàn)來判定pH值，建議使用pH計(jì)進(jìn)行測定。酚紅通常對含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基生產(chǎn)的生物制品質(zhì)量并不會產(chǎn)生明顯影響，也可通過純化技術(shù)去除，但酚紅在無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中可能帶來胞內(nèi)鈉/鉀失衡，影響細(xì)胞生長，這種作用能被血清所中和或減輕。因此，酚紅并不是細(xì)胞培養(yǎng)基中必需的一種成份，很多國外的疫苗或抗體生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過程中都使用無酚紅細(xì)胞培養(yǎng)基。
碳酸氫鈉在細(xì)胞培養(yǎng)基中主要是作為緩沖系統(tǒng)，此外還具有調(diào)節(jié)滲透壓的作用。通常產(chǎn)品使用說明中的碳酸氫鈉推薦量是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)、安全量，是在科學(xué)的基礎(chǔ)上根據(jù)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)所得，但是由于不同的細(xì)胞系（株）不同，同一株細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境也可能不同（細(xì)胞耐受性不同等），且存在的地域性水質(zhì)差異等，在實(shí)際生產(chǎn)過程中也可稍作改動，但使用者需做相應(yīng)的檢測（理化及細(xì)胞生產(chǎn)試驗(yàn)等）。
HEPES是一種非離子緩沖液，在pH 7.2 ～7.4范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力，其在高濃度時(shí)對一些細(xì)胞可能有毒。HEPES緩沖液可與低水平的碳酸鈉（0.34 g /L）共用，以抵消因額外加入HEPES引起的滲透壓增加。其安全濃度范圍是10～25 mmol/L。
丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。
谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃下放置1周可分解50%，使用中最好單獨(dú)配制，置-20℃冰箱中保存，使用前加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。
（3）細(xì)胞培養(yǎng)基使用相關(guān)問題
一旦在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用完畢。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞菰诮鈨龊缶烷_始降解。此外，當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%，因?yàn)檠逯械牡鞍讜Y(jié)合和滅活一些抗生素，而在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活。
通常液體細(xì)胞培養(yǎng)基在冷藏條件下可存放6個(gè)月到一年，如果細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，應(yīng)該使其自然溶解并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒有沉淀產(chǎn)生，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。
（4）細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)問題
細(xì)胞凍存講究“慢凍”。動物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5～10% 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO) 和90～95%原來細(xì)胞生長用的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基均勻混合。由于DMSO稀釋時(shí)會放出大量熱能，不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中，在使用前先行配制完成。用于細(xì)胞凍存的大部份添加物和試劑要冷藏，常用液體細(xì)胞培養(yǎng)基用于凍存時(shí)，最多可以凍融3次，如果次數(shù)過多會將使含有的蛋白質(zhì)發(fā)生降解和沉淀，這將會影響培養(yǎng)基的性能。
體外培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞大多具有生長接觸抑制的特性，即當(dāng)一個(gè)細(xì)胞被其他細(xì)胞包圍的時(shí)候，它就會停止生長，及時(shí)傳代后，細(xì)胞的生長得以繼續(xù)。一般采用胰蛋白酶消化的方式進(jìn)行傳代。胰蛋白酶溶液的消化能力與溶液的pH、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca2+,Mg2+離子和血清等因素有關(guān)，通常情況下胰蛋白酶在pH8.0、溫度37℃時(shí)作用能力最強(qiáng)，鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力，每次進(jìn)行傳代消化前，先用不含鈣、鎂離子的緩沖液沖洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶，去除殘留的含血清的培養(yǎng)液，能明顯提高消化液的消化能力。多數(shù)細(xì)胞傳代消化使用的消化液為PBS溶液中添加0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA，EDTA主要是用來螯合能夠抑制蛋白酶活性的游離的鎂離子和鈣離子，以保持胰蛋白酶的活性。
通常細(xì)胞消化的時(shí)間越短越好，但是不同的細(xì)胞，其貼壁性有一定的差異，對于易消化的細(xì)胞控制其消化程度，對于貼壁性較強(qiáng)的細(xì)胞，在消化時(shí)可將消化液事先在37℃條件下進(jìn)行預(yù)熱，消化時(shí)盡量控制在37℃條件下進(jìn)行，可加快消化的時(shí)間及降低對細(xì)胞的損傷。值得注意的是，胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定。
（5）細(xì)胞的污染判斷及污染的消除
細(xì)菌、真菌類污染較易判斷，但是支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞的生長參數(shù)、代謝及研究中的任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞未被支原體污染，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)方有意義。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無法以其外觀分辨之。通常污染的細(xì)胞直接丟棄不再使用。
當(dāng)重要的培養(yǎng)細(xì)胞污染而不能丟棄時(shí)，需消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺，檢查過濾器等。其次，高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時(shí)尤其重要。
下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。
1）在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。
2）分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0，8.0mg/ml。
3）每天觀測細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。
4）確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2－3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2－3代。
5）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。
6）重復(fù)步驟4。
7）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4－6代，確定污染是否以已被消除。
中國微生物查詢網(wǎng)（family998.com）