細胞培養(yǎng)之“收到細胞的處理方式”
中國微生物菌種查詢網(wǎng) / 2016-12-02 09:24:28
No.1
1.收到細胞株包裹時，請檢查細胞株冷凍管是否有解凍情形，若有請立即通知。細胞株請盡速開始培養(yǎng)，或立即冷凍保存(置于–70C，隔夜后，移到液氮)。
2.冷凍細胞解凍程序:
2.1.依據(jù)細胞株數(shù)據(jù)單指定之基礎培養(yǎng)基種類、血清種類和其它指定之成份和比例，制備培養(yǎng)基。絕大多數(shù)之細胞均無法立即適應不同之基礎培養(yǎng)基或不同之血清種類，若因?qū)嶒炐枰?，必須有所不同時，務必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成，確定細胞適應后，方進行所需之實驗。
2.2.FBS(fetalbovineserum,胚牛血清),CS(calfserum,小牛血清)和HS(horseserum,馬血清)，對細胞而言差異極大，請務必依據(jù)細胞株資料單指定之血清種類培養(yǎng)之。
2.3.將潔特培養(yǎng)基置于37C水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。取出潔特冷凍管，立即放入37C水槽中快速解凍，水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿，否則易發(fā)生污染。輕搖潔特冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化后，以70%ethanol擦拭冷凍管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。
2.4.依據(jù)細胞種類和濃度，于無菌操作臺內(nèi)取10ml培養(yǎng)基加至T25或T75flask中。取出已解凍之細胞懸浮液，緩緩加入T25或T75JET培養(yǎng)瓶內(nèi)之培養(yǎng)基，混合均勻，放入37C，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
2.5.對絕大多數(shù)細胞而言，1%以下之冷凍保護劑DMSO，不會對細胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細胞中去除，待第二天確定細胞生長或貼附良好后再去除即可。惟對極少數(shù)因?qū)MSO敏感或會造成細胞分化之細胞，需立即去除DMSO者，則可將解凍后之細胞懸浮液放入5-10ml潔特培養(yǎng)基中，離心300xg(約1000rpm)，5分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮的潔特培養(yǎng)基，將細胞均勻混合后，轉(zhuǎn)移至潔特培養(yǎng)瓶中，再放入37°C，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
No.2
收到T25JET培養(yǎng)瓶培養(yǎng)出的細胞時，處理方式為︰
1.于寄送過程中，為避免起泡造成細胞脫落死亡，T25flask均加滿潔特培養(yǎng)基。請檢查培養(yǎng)瓶的外觀，并于顯微鏡下觀察細胞生長狀況和有無污染現(xiàn)象，若有任何問題，不要打開蓋子，請立即通知細胞實驗室。
2.將原封之T25JET培養(yǎng)瓶靜置于37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中，使細胞回溫至37°C，并讓運送過程中少數(shù)脫落的細胞可再附著生長。隔天后，于無菌操作箱內(nèi)取出JET培養(yǎng)瓶內(nèi)之培養(yǎng)基，(取出之培養(yǎng)基可以再使用)，僅留約5-10ml培養(yǎng)基于JET培養(yǎng)瓶內(nèi)，依一般培養(yǎng)方式再將細胞置入培養(yǎng)箱中，或細胞已長滿盤，則將細胞做傳代培養(yǎng)。
細胞計數(shù)與存活測試
1.原理：
1.1.計算細胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coultercounter粒子計數(shù)器自動計數(shù)。
1.2.血球計數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber中細刻9個1mm2大正方形，其中4個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2x0.1mm=1.0x10-4ml。使用時，計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細胞數(shù)目。
1.3.存活測試之步驟為dyeexclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypanblue染料，如果細胞不易吸收trypanblue，則用紅色之Erythrosinbluish。
2.材料：
0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)
Erythosinbluishstain
取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及0.05grampreservativemethylparaben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline
血球計數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip)，計數(shù)器(counter)，低倍倒立顯微鏡
粒子計數(shù)器(Coultercounter,CoulterElectronics)
3.步驟：
3.1.取50ml細胞懸浮液與50mltrypanblue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。
3.2.取少許混合液(約15ml)自血球計數(shù)盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色(或紅色-Erythrosinbluish)。
3.3.計數(shù)四個大方格之細胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypanblue等體積混合)，最后乘以104，即為每ml中細胞懸浮液之細胞數(shù)。若細胞位于線上，只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。
4大格*細胞總數(shù)x2x104/4=細胞數(shù)/ml
*每一大格的體積=0.1cmx0.1cmx0.01cm=10-4ml
3.4.若不用血球計數(shù)盤，可用Coultercounter作自動計數(shù)，惟無法辨別死細胞或活細胞。
3.5.范例：
T75monolayerculture制成10ml細胞懸浮液，取0.1ml溶液與0.1mltrypanblue混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計數(shù)盤，計數(shù)四大方格內(nèi)之細胞數(shù)目。
活細胞數(shù)/方格：55,62,49,59死細胞數(shù)/方格：5,3,4,6
細胞總數(shù)=243平均細胞數(shù)/方格=60.75稀釋倍數(shù)=2
細胞數(shù)/ml：60.75x104x2=1.22x106細胞數(shù)/flask：1.22x106x10ml=12.2x106
存活率：225/243﹦92.6%
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