一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?
1．明確培養(yǎng)基的配制原理。
2．通過(guò)對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。
3．了解常用培養(yǎng)基的制備方法。
二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與原理
培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。在自然界中，微生物種類(lèi)繁多，營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型多樣，加之實(shí)驗(yàn)和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類(lèi)很多。但是，不同種類(lèi)的培養(yǎng)基中，一般應(yīng)含有水分、碳源、氮源、能源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因素等。不同微生物對(duì)pH要求不一樣，霉菌和酵母的培養(yǎng)基的pH一般是偏酸性的，而細(xì)菌和放線菌的培養(yǎng)基的pH一般為中性或微堿性的(嗜堿細(xì)菌和嗜酸細(xì)菌例外)。所以配制培養(yǎng)基時(shí)，都要根據(jù)不同微生物的要求將培養(yǎng)基的pH調(diào)到合適的范圍。按成分的不同分天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基。按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基。按培養(yǎng)基的用途分基礎(chǔ)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(加富培養(yǎng)基)、鑒別培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基。
牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有時(shí)又稱為普通培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需要的最基本的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以可供作微生物生長(zhǎng)繁殖之用?；A(chǔ)培養(yǎng)基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏為微生物提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素，而NaCl提供無(wú)機(jī)鹽。在配制固體培養(yǎng)基時(shí)還要加入一定量瓊脂作凝固劑，瓊脂在常用濃度下96℃時(shí)溶化，實(shí)際應(yīng)用時(shí)，一般在沸水浴中或下面墊以石棉網(wǎng)煮沸溶化，以免瓊脂燒焦。瓊脂在40℃時(shí)凝固，通常不被微生物分解利用。固體培養(yǎng)基中瓊脂的含量根據(jù)瓊脂的質(zhì)量和氣溫的不同而有所不同。
由于這種培養(yǎng)基多用于培養(yǎng)細(xì)菌，因此要用稀酸或稀堿將其pH調(diào)至中性或微堿性，以利于細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。
三、主要儀器與設(shè)備
1．溶液或試劑 牛肉膏，蛋白胨，NaCl，瓊脂，1 mol/L NaOH，1 mol/L HCl。
2．儀器或其他用具 試管，培養(yǎng)皿，三角瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，牛角匙，高壓蒸氣滅菌鍋，電烘箱，pH試紙(pH 5.5～9.0)，棉花，牛皮紙，記號(hào)筆，麻繩，紗布等。
四、操作方法、實(shí)驗(yàn)步驟
（一）掌握牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制方法
100牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方如下：
（1）液體
牛肉膏 0.3g
蛋白胨 1g
NaCl 0.5 g
蒸餾水 1 00 ml
pH 7.4～7.6
（2）半固體 100mL液體培養(yǎng)基調(diào)完pH以后加0.8g瓊脂
（3）固體 100mL液體培養(yǎng)基調(diào)完pH以后加2g瓊脂
1．稱量
按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放人燒杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。也可放在稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時(shí)如稍微加熱，牛肉膏便會(huì)與稱量紙分離，然后立即取出紙片。
蛋白胨很易吸濕，在稱取時(shí)動(dòng)作要迅速。另外，稱藥品時(shí)嚴(yán)防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈，擦干，再稱取另—藥品。瓶蓋也不要蓋錯(cuò)。
2．溶化
在上述燒杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。將藥品完全溶解后，補(bǔ)充水到所需的總體積，如果配制固體培養(yǎng)基時(shí)，將稱好的瓊脂放入已溶的藥品中，再加熱溶化，最后補(bǔ)足所損失的水分。在制備用三角瓶盛固體培養(yǎng)基時(shí)，一般也可先將一定量的液體培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，然后按1.5％～2.0％的量將瓊脂直接分別加入各三角瓶中，不必加熱溶化，圖Ⅳ-1 磁力攪拌加熱溶解圖
而是滅菌和加熱溶化同步進(jìn)行，節(jié)省時(shí)間。
在瓊脂溶化過(guò)程中，應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器。同時(shí)，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦。配制培養(yǎng)基時(shí)，不可用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進(jìn)入培養(yǎng)基中，影響細(xì)菌生長(zhǎng)。
3．調(diào)pH
在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測(cè)量培養(yǎng)基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1 mol／L NaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測(cè)其pH，直至pH達(dá)7.6。反之，用1mol/L HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。
對(duì)于有些要求pH較精確的微生物，其pH的調(diào)節(jié)可用酸度計(jì)進(jìn)行(使用方法、可參考有關(guān)說(shuō)明書(shū))。
pH不要調(diào)過(guò)頭，以避免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。配制pH低的瓊脂培養(yǎng)基時(shí)，若預(yù)先調(diào)好pH并在高壓蒸氣下滅菌，則瓊脂因水解不能凝固。因此，應(yīng)將培養(yǎng)基的成分和瓊脂分開(kāi)滅菌后再混合，或在中性PH條件下滅菌，再調(diào)整pH。
4．過(guò)濾
趁熱用濾紙或多層紗布過(guò)濾，以利某些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察。一般無(wú)特殊要求的情況下，這一步可以省去(本實(shí)驗(yàn)勿需過(guò)濾)。
5．分裝
按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角燒瓶?jī)?nèi)。分裝過(guò)程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管(瓶)口上，以免沾污棉塞而引起污染。
(1) 液體分裝 分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。分裝三角瓶的量則根據(jù)需要而定，一般以不超過(guò)三角瓶容積的一半為宜，如果是用于振蕩培養(yǎng)用，則根據(jù)通氣量的要求酌情減少；有的液體培養(yǎng)基在滅菌后，需要補(bǔ)加一定量的其他無(wú)菌成分，如抗生素等，則裝量一定要準(zhǔn)確。
(2) 固體分裝 分裝試管，其裝量不超過(guò)管高的1/5，滅菌后制成斜面。分裝三角燒瓶的量以不超過(guò)三角燒瓶容積的一半為宜。
6．加塞
培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞(或泡沫塑料塞及試管帽等)，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能(棉塞制作方法附本實(shí)驗(yàn)后面)。
7．包扎
加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤(rùn)濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好，使用時(shí)容易解開(kāi)，同樣用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。
(有條件的實(shí)驗(yàn)室，可用市售的鋁箔代替牛皮紙，省去用繩扎，而且效果好。)
8．滅菌
將上述培養(yǎng)基以0.103 MPa，121℃，20 min高壓蒸氣滅菌。
9．?dāng)R置斜面
將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，將試管口端擱在玻棒或其他合適高度的器具上，擱置的斜面長(zhǎng)度以不超過(guò)試管總長(zhǎng)的一半為宜。
10. 制備固體平板培養(yǎng)基
用烘箱將表面皿滅菌后備用。在超凈工作臺(tái)上趁熱將滅菌后的培養(yǎng)基傾倒到表面皿中，放涼，備用。
11．無(wú)菌檢查
將滅菌培養(yǎng)基放人37℃的溫室中培養(yǎng)24～48h，以檢查滅菌是否徹底。
（二）了解蛋白胨水培養(yǎng)基的配制方法
蛋白胨 20 g
NaCl 5 g
蒸餾水 1 000 ml
pH 7.6
（三）了解乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基的配制方法
蛋白胨水培養(yǎng)基 1 000 ml
1.6％溴甲酚紫乙醇溶液 1～2 ml
pH 7.6
另配20％乳糖溶液：乳糖5g溶于25mL蒸餾水中。
制法：調(diào)完pH7.6后加入乳糖溶液10mL，分裝，在每只試管內(nèi)放一倒置的小玻璃管（Durham tube），使充滿培養(yǎng)液。滅菌。
（四）了解葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基的配制方法
蛋白胨水培養(yǎng)基 1 000 ml
1.6％溴甲酚紫乙醇溶液 1～2 ml
pH 7.6
另配20％葡萄糖溶液：葡萄糖5g溶于25mL蒸餾水中。
制法：調(diào)完pH7.6后加入乳糖溶液10mL，分裝，在每只試管內(nèi)放一倒置的小玻璃管（Durham tube），使充滿培養(yǎng)液。滅菌。
（五）了解葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基的配制方法
蛋白胨 5 g
葡萄糖 5 g
K2HPO4 2 g
蒸餾水 1 000 ml
將上述各成分溶于1 000 ml水中，調(diào)pH7.0～7.2，過(guò)濾。分裝試管，每管10 ml，112℃滅菌30min。
（六）了解檸檬酸鹽培養(yǎng)基的配制方法
NH4H2PO4 1.5g
K2HPO4 l .5g
NaCl 7.5 g
MgSO4 0.3 g
檸檬酸鈉 3g
蒸餾水 1 000 ml
1％溴香草酚藍(lán)乙醇溶液 10 ml
將上述各成分加熱溶解后，調(diào)pH6.8，加入瓊脂30g，然后加入指示劑，搖勻。制成后為黃綠色，分裝試管，121℃滅菌20 min后制成斜面。注意配制時(shí)控制好pH，不要過(guò)堿，以黃綠色為準(zhǔn)。
（七）了解醋酸鉛培養(yǎng)基的配制方法
pH7.4的牛肉膏蛋白胨瓊脂 100 ml
硫代硫酸鈉 0.25 g
10％醋酸鉛水溶液 1 ml
將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基100 ml加熱溶解，待冷至60℃時(shí)加入硫代硫酸鈉0.25 g，調(diào)至pH7.2，分裝于三角瓶中，115℃滅菌15 min。取出后待冷至55～60℃，加入10％醋酸鉛水溶液(無(wú)菌的)1ml，混勻后倒入滅菌試管或平板中。
（八）了解血瓊脂培養(yǎng)基的配制方法
pH7.6的牛肉膏蛋白胨瓊脂 100 ml
脫纖維羊血(或兔血) 10 ml
將牛肉膏蛋白胨瓊脂加熱溶化，待冷至50℃時(shí)，加入無(wú)菌脫纖維兔血搖勻后倒平板或制成斜面。37℃過(guò)夜檢查無(wú)菌生長(zhǎng)即可使用。
注：無(wú)脫纖維兔血(或羊血)的制備
用配備18號(hào)針頭的注射器以無(wú)菌操作抽取全血，并立即注入裝有無(wú)菌玻璃珠(約3 mm)的無(wú)菌三角瓶中，然后搖動(dòng)三角瓶10 min左右，形成的纖維蛋白塊會(huì)沉淀在玻璃珠上，把含血細(xì)胞和血清的上清液傾入無(wú)菌容器即得到脫纖維兔血，置冰箱備用。整個(gè)過(guò)程必須嚴(yán)格無(wú)菌操作；制備脫纖維血液時(shí)，應(yīng)搖動(dòng)足夠時(shí)間以防凝固。
將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基溶化，待冷至45℃～50℃時(shí)，以無(wú)菌操作按10％加入無(wú)菌脫纖維兔血(或羊血)于培養(yǎng)基中，立即搖蕩，以便血液和培養(yǎng)基充分混勻。45℃～50℃加入血液是為了保存其中某些不耐熱的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和保存血細(xì)胞的完整，以便于觀察細(xì)菌的溶血作用。同時(shí)，在這種溫度時(shí)瓊脂不會(huì)凝固。迅速以無(wú)菌操作倒入無(wú)菌平皿中，使成血液瓊脂平板。注意不要產(chǎn)生氣泡。置37℃過(guò)夜，如無(wú)菌生長(zhǎng)即可使用。
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