培養(yǎng)基是提供微生物生長(zhǎng)繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物所需要的、按一定比例配制的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基組成對(duì)菌體生長(zhǎng)繁殖、產(chǎn)物的生物合成、產(chǎn)品的分離精制乃至產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量都有重要的影響。微生物的營(yíng)養(yǎng)活動(dòng)是依靠向外界分泌大量的酶，將周圍環(huán)境中大分子蛋白質(zhì)、糖類、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解成小分子化合物，借助于細(xì)胞膜的滲透作用，吸收這些小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。不同的微生物的生長(zhǎng)情況不同或合成不同的發(fā)酵產(chǎn)物時(shí)所需的培養(yǎng)基有所不同，但對(duì)于所有發(fā)酵生產(chǎn)用培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)仍存在某些共同點(diǎn)可供遵循，這就是所有的發(fā)酵培養(yǎng)基都必須提供微生物生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)物合成所需的碳源、氮源、無(wú)機(jī)元素、生長(zhǎng)因子、水和氧氣等。對(duì)于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，除考慮上述微生物的需要外，還必須重視培養(yǎng)基原料的價(jià)格和來(lái)源。
一、培養(yǎng)基的選擇
不同的微生物對(duì)培養(yǎng)基的需求是不同的，因此，不同微生物培養(yǎng)過(guò)程對(duì)原料的要求也是不一樣的。應(yīng)根據(jù)具體情況，從微生物營(yíng)養(yǎng)要求的特點(diǎn)和生產(chǎn)工藝的要求出發(fā)，選擇合適的營(yíng)養(yǎng)基，使之既能滿足微生物生長(zhǎng)的需要，又能獲得高產(chǎn)的產(chǎn)品，同時(shí)也要符合增產(chǎn)節(jié)約、因地制宜的原則。
⒈ 根據(jù)微生物的特點(diǎn)選擇培養(yǎng)基
用于大規(guī)模培養(yǎng)的微生物主要有細(xì)菌、酵母菌、霉菌和放線菌等四大類。它們對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求不盡相同，有共性也有各自的特性。在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，要依據(jù)微生物的不同特性，來(lái)考慮培養(yǎng)基的組成，對(duì)典型的培養(yǎng)基配方需作必要的調(diào)整。
⒉ 根據(jù)發(fā)酵方式選擇培養(yǎng)基
液體和固體培養(yǎng)基各有用途，也各有優(yōu)缺點(diǎn)。在液體培養(yǎng)基中，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是以溶質(zhì)狀態(tài)溶解于水中，這樣微生物就能更充分接觸和利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，更有利于微生物的生長(zhǎng)和更好地積累代謝產(chǎn)物。工業(yè)上，利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行的深層發(fā)酵具有發(fā)酵效率高，操作方便，便于機(jī)械化、自動(dòng)化，降低勞動(dòng)強(qiáng)度，占地面積小，產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。所以發(fā)酵工業(yè)中大多采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)種子和進(jìn)行發(fā)酵，并根據(jù)微生物對(duì)氧的需求，分別作靜止或通風(fēng)培養(yǎng)。而固體培養(yǎng)基則常用于微生物菌種的保藏、分離、菌落特征鑒定、活細(xì)胞數(shù)測(cè)定等方面。此外，工業(yè)上也常用一些固體原料，如小米、大米、麩皮、馬鈴薯等直接制作成斜面或茄子瓶來(lái)培養(yǎng)霉菌、放線菌。
⒊ 從生產(chǎn)實(shí)踐和科學(xué)試驗(yàn)的不同要求選擇
生產(chǎn)過(guò)程中，由于菌種的保藏、種子的擴(kuò)大培養(yǎng)到發(fā)酵生產(chǎn)等各個(gè)階段的目的和要求不同，因此，所選擇的培養(yǎng)基成分配比也應(yīng)該有所區(qū)別。一般來(lái)說(shuō)，種子培養(yǎng)基主要是供微生物菌體的生長(zhǎng)和大量增殖。為了在較短的時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)量較多的強(qiáng)壯的種子細(xì)胞，種子培養(yǎng)基要求營(yíng)養(yǎng)豐富、完全，氮源、維生素的比例應(yīng)較高，所用的原料也應(yīng)是易于被微生物菌體吸收利用。常用葡萄糖、硫酸銨、尿素、玉米漿、酵母膏、麥芽汁、米曲汁等作為原料配制培養(yǎng)基。而發(fā)酵培養(yǎng)基除需要維持微生物菌體的正常生長(zhǎng)外，主要是要求合成預(yù)定的發(fā)酵產(chǎn)物，所以，發(fā)酵培養(yǎng)基碳源物質(zhì)的含量往往要高于種子培養(yǎng)基。當(dāng)然，如果產(chǎn)物是含氮物質(zhì)，應(yīng)相應(yīng)地增加氮源的供應(yīng)量。除此之外，發(fā)酵培養(yǎng)基還應(yīng)考慮便于發(fā)酵操作以及不影響產(chǎn)物的提取分離和產(chǎn)品的質(zhì)量。
⒋ 從經(jīng)濟(jì)效益方面考慮選擇生產(chǎn)原料
從科學(xué)的角度出發(fā)，培養(yǎng)基的經(jīng)濟(jì)性通常是不被那么重視，而對(duì)于生產(chǎn)過(guò)程來(lái)講，由于配制發(fā)酵培養(yǎng)基的原料大多是糧食、油脂、蛋白質(zhì)等，且工業(yè)發(fā)酵消耗原料量大，因此，在工業(yè)發(fā)酵中選擇培養(yǎng)基原料時(shí)，除了必須考慮容易被微生物利用并滿足生產(chǎn)工藝的要求外，還應(yīng)考慮到經(jīng)濟(jì)效益，必須以價(jià)廉、來(lái)源豐富、運(yùn)輸方便、就地取材以及沒(méi)有毒性等為原則選擇原料。
二、培養(yǎng)基的配制原則
培養(yǎng)基的配制必須提供合成微生物細(xì)胞和發(fā)酵產(chǎn)物的基本成分；有利于減少培養(yǎng)基原料的單耗，單位營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)所合成產(chǎn)物數(shù)量大或產(chǎn)率大；有利于提高培養(yǎng)基產(chǎn)物的濃度，以提高單位容積發(fā)酵罐的生產(chǎn)能力；有利于提高產(chǎn)物的合成速度，縮短發(fā)酵周期；盡量減少副產(chǎn)物的形成；減少對(duì)發(fā)酵過(guò)程中通氣攪拌的影響，有利于提高氧的利用率、降低能耗；有利于產(chǎn)品的分離和純化；并盡可能減少產(chǎn)生“三廢”的物質(zhì)。
當(dāng)然，設(shè)計(jì)任何一種培養(yǎng)基都不可能面面俱到地滿足上述各項(xiàng)要求，需根據(jù)具體情況，抓主要環(huán)節(jié)。使其即滿足微生物的營(yíng)養(yǎng)要求，又能獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的產(chǎn)品，同時(shí)也符合增產(chǎn)節(jié)約、因地制宜的原則。發(fā)酵培養(yǎng)基的主要作用是為了獲得預(yù)期的產(chǎn)物，必須根據(jù)產(chǎn)物特點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)培養(yǎng)基。因此要求營(yíng)養(yǎng)要適當(dāng)豐富和完備，菌體迅速生長(zhǎng)和健壯，整個(gè)代謝過(guò)程pH值適當(dāng)且穩(wěn)定；糖、氮代謝能完全符合高單位罐、批的要求，能充分發(fā)揮生產(chǎn)菌種合成代謝產(chǎn)物的能力。此外還要求成本降低。
⒈ 根據(jù)不同微生物的營(yíng)養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基
不同的微生物所需要的培養(yǎng)基成分是不同的，要確定一個(gè)合適的培養(yǎng)基，就需要了解生產(chǎn)用菌種的來(lái)源、生理生化特性和一般的營(yíng)養(yǎng)要求，根據(jù)不同生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)條件、生物合成的代謝途徑、代謝產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)等確定培養(yǎng)基。
⒉ 營(yíng)養(yǎng)成分的恰當(dāng)配比
微生物所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之間應(yīng)有適當(dāng)?shù)谋壤?，培養(yǎng)基中的碳氮的比例(C／N)在發(fā)酵工業(yè)中尤其重要。不同的微生物菌種、不同的發(fā)酵產(chǎn)物所要求的碳氮比是不同的。菌體在不同生長(zhǎng)階段，對(duì)其碳氮比的最適要求也不一樣。培養(yǎng)基的碳氮比不僅會(huì)影響微生物菌體的生長(zhǎng)，同時(shí)也會(huì)影響到發(fā)酵的代謝途徑。由于碳既作碳架又作能源，所以用量要比氮多。從元素分析來(lái)看，酵母細(xì)胞中碳氮比約為100:20，霉菌約為100:10。一般發(fā)酵工業(yè)中培養(yǎng)基碳氮比約為100: (0.2～2.0)，但在氨基酸發(fā)酵中，因?yàn)楫a(chǎn)物中含有氮，所以碳氮比就相對(duì)高一些。如谷氨酸發(fā)酵的碳氮比為100: (15～21)，若碳氮比為100: (0.2～2.0)，則會(huì)出現(xiàn)只長(zhǎng)菌體，幾乎不產(chǎn)谷氨酸的現(xiàn)象。
碳氮比隨碳水化合物及氮源的種類以及通氣攪拌等條件而異，很難確定統(tǒng)一的比值。一般情況下，碳氮比偏小，能導(dǎo)致菌體的旺盛生長(zhǎng)，易造成菌體提前衰老自溶，影響產(chǎn)物的積累；碳氮比過(guò)大，菌體繁殖數(shù)量少，不利于產(chǎn)物的積累；碳氮比較合適，但碳源、氮源濃度高，仍能導(dǎo)致菌體的大量繁殖，增大發(fā)酵液粘度，影響溶解氧濃度，容易引起菌體的代謝異常，影響產(chǎn)物合成；碳氮比較合適，但碳源、氮源濃度過(guò)低，會(huì)影響菌體的繁殖，同樣不利于產(chǎn)物的積累。
⒊ 滲透壓
配制培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)注意營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)要有合適的濃度。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度太低，不僅不能滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求，而且也不利于提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量和提高設(shè)備的利用率。但是，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度過(guò)高時(shí)，由于培養(yǎng)基溶液的滲透壓太大，會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)。此外培養(yǎng)基中的各種離子的濃度比例也會(huì)影響到培養(yǎng)基的滲透壓和微生物的代謝活動(dòng)，因此，培養(yǎng)基中各種離子的比例需求要平衡。在發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，在不影響微生物的生理特性和代謝轉(zhuǎn)化率的情況下，通常趨向在較高濃度下進(jìn)行發(fā)酵，以提高產(chǎn)物產(chǎn)量，并盡可能選育高滲透壓的生產(chǎn)菌株。當(dāng)然，培養(yǎng)基濃度太大會(huì)使培養(yǎng)基黏度增加和溶氧量降低。
⒋ pH值
各種微生物的正常生長(zhǎng)均需要有合適的pH值，一般霉菌和酵母菌比較適于微酸性環(huán)境，放線菌和細(xì)菌適于中性或微堿性環(huán)境。為此，當(dāng)培養(yǎng)基配制好后，若pH值不合適，必須加以調(diào)節(jié)。當(dāng)微生物在培養(yǎng)過(guò)程中改變培養(yǎng)基的pH值而不利于本身的生長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)以微生物菌體對(duì)各種營(yíng)養(yǎng)成分的利用速度來(lái)考慮培養(yǎng)基的組成，同時(shí)加入緩沖劑，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值。
⒌ 氧化還原電位
對(duì)大多數(shù)微生物來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)基的氧化還原電位一般對(duì)其生長(zhǎng)的影響不大，即適合它們生長(zhǎng)的氧化還原電位范圍較廣。但對(duì)于厭氧菌，由于氧的存在對(duì)其有毒害作用，因而往往在培養(yǎng)基中加入還原劑以降低氧化還原電位。
在配制培養(yǎng)基時(shí)，除應(yīng)注意以上幾條原則外，還要考慮到營(yíng)養(yǎng)成分的加入順序，為了避免生成沉淀而造成營(yíng)養(yǎng)成分的損失，加入的順序一般為先加入緩沖化合物，溶解后加入主要物質(zhì)，然后加入維生素、氨基酸等生長(zhǎng)素類的物質(zhì)。
三、培養(yǎng)基成分配比的選擇
培養(yǎng)基的組分(包括這些組分的來(lái)源和加入方法)、配比、緩沖能力、黏度、滅菌是否徹底、滅菌后營(yíng)養(yǎng)破壞的程度及原料中雜質(zhì)的含量都對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成有影響。目前還只能在生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等的基本理論指導(dǎo)下，參照前人所使用的較適合于某一類菌種的培養(yǎng)基（常稱為基礎(chǔ)培養(yǎng)基）的經(jīng)驗(yàn)配方，再結(jié)合所用菌種和產(chǎn)品的特性，采用搖瓶等小型發(fā)酵設(shè)備，對(duì)碳、氮、無(wú)機(jī)鹽和前體等進(jìn)行逐個(gè)單因子試驗(yàn)，觀察這些因子對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成量的影響，最后再綜合考慮各因素的影響，得到一個(gè)適合該菌種的培養(yǎng)基的配方，在大規(guī)模生產(chǎn)中進(jìn)行必要的調(diào)整，以獲得高產(chǎn)。
為了減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，可考慮用“正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)”等數(shù)學(xué)方法來(lái)確定培養(yǎng)基組分和濃度，它可以通過(guò)比較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)而得到較滿意的結(jié)果，另外，還可通過(guò)方差分析，了解哪些因素影響較大，以引起人們的注意。
需要注意的是考慮碳源、氮源時(shí)，要注意快速利用的碳(氮)源和慢速利用的碳(氮)源的相互配合，發(fā)揮各自優(yōu)勢(shì)，避其所短，選用適當(dāng)?shù)奶嫉龋–/N）。氮源過(guò)多，則菌體繁殖旺盛，pH值偏高，不利于代謝產(chǎn)物的積累；氮源不足，則菌體繁殖量少，從而影響產(chǎn)量。碳源過(guò)多，則容易形成較低的pH值；碳源不足，菌體衰老和自溶。在考慮培養(yǎng)基所用的有機(jī)氮源時(shí)，要特別注意原料的來(lái)源、加入方法和有效成分的含量。制備培養(yǎng)基時(shí)，也應(yīng)該考慮水分含量。
另外還要注意生理酸、堿性鹽和pH緩沖劑的加入和搭配，根據(jù)該菌種在現(xiàn)有工藝設(shè)備的條件下，其生長(zhǎng)和合成產(chǎn)物時(shí)pH值的變化情況，以及最適pH值所控制范圍等，綜合考慮選用什么生理酸、堿性物質(zhì)及用量，從而保證在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中pH值都能維持在最佳狀態(tài)。有時(shí)考慮用中間補(bǔ)料來(lái)控制pH值。凡是代謝后能產(chǎn)生酸性物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)成分叫生理酸性物質(zhì)，如硫酸銨。凡是代謝后能產(chǎn)生堿性物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)成分叫生理堿性物質(zhì)，如硝酸鹽、乙酸鈉等。
培養(yǎng)基各成分用量的多少，大部分是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)而來(lái)。但有些初級(jí)代謝產(chǎn)物因?yàn)樗鼈兊拇x途徑較清楚，所以根據(jù)物料平衡計(jì)算來(lái)加以確定。
對(duì)于次級(jí)代謝產(chǎn)物，生物合成途徑了解有限，根據(jù)化學(xué)計(jì)算比較困難，但也有人根據(jù)物料平衡計(jì)算了碳源轉(zhuǎn)化為青霉素的得率。
上式計(jì)算青霉素G的理論得率為每克葡萄糖得1.1 g青霉素G。在確定培養(yǎng)基中碳源數(shù)量時(shí)，還要考慮用于菌體生長(zhǎng)和維持所需的消耗。
培養(yǎng)基在大規(guī)模生產(chǎn)中用量很大，在選用時(shí)應(yīng)盡量地利用較豐富的廉價(jià)原料，設(shè)法降低成本。例如，賴氨酸(Lys)生產(chǎn)中先選用山芋淀粉，后改為用山芋粉為碳源，這樣不僅價(jià)廉，而且山芋粉中還含有生物素、鎂鹽等，省去了原來(lái)所加的玉米漿、硫酸鎂，并使整個(gè)成本降低15％。
工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基
從微生物的營(yíng)養(yǎng)要求來(lái)看，所有的微生物都需要碳源、氮源、無(wú)機(jī)元素、水、能源和生長(zhǎng)物質(zhì)，如果是好氧微生物則還需要氧氣。碳源是供給菌體生命活動(dòng)所需的能量和構(gòu)成菌體細(xì)胞以及代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)。氮源主要是構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，即蛋白質(zhì)、氨基酸等之類的含氮代謝物。微生物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和生物合成過(guò)程也需要大量元素和微量元素，如鎂、硫、磷、鉀、錳等。一些特殊的微量生長(zhǎng)因子如生物素、硫胺素、肌醇等，對(duì)缺陷型微生物是必不可少的。生物體內(nèi)各種生化作用必須在水溶液中進(jìn)行，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)必須溶解于水中，才能透過(guò)細(xì)胞膜被微生物利用。另外有些產(chǎn)品的生產(chǎn)還需要使用誘導(dǎo)劑、前體和促進(jìn)劑。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上配制含有純化合物的培養(yǎng)基是相當(dāng)簡(jiǎn)單的，雖然它能滿足微生物的生長(zhǎng)要求，但在大規(guī)模生產(chǎn)上往往是不適合的。在發(fā)酵工業(yè)中，必須使用廉價(jià)的原料來(lái)配制培養(yǎng)基，使之盡可能地滿足下列條件：① 消耗每克底物將產(chǎn)生最大的菌體得率或產(chǎn)物得率；② 能產(chǎn)生最高的產(chǎn)品或菌體的濃度；③ 能得到產(chǎn)物生成的最大速率；④ 副產(chǎn)品的得率最?。虎?價(jià)廉并具有穩(wěn)定的質(zhì)量；⑥ 來(lái)源豐富且供應(yīng)充足；⑦ 通氣和攪拌、提取、純化、廢物處理等生產(chǎn)工藝過(guò)程都比較容易。
用甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、谷物淀粉等作為碳源，用銨鹽、尿素、硝酸鹽、玉米漿及發(fā)酵的殘余物作為氮源，便能較好地滿足上述配制培養(yǎng)基的條件。
值得注意的是培養(yǎng)基的選擇還會(huì)影響到發(fā)酵罐的設(shè)計(jì)。例如用甲醇和氨生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白是用氣升式反應(yīng)器代替普通的機(jī)械通用攪拌罐，從而克服了由于高速通氣和高速攪拌所產(chǎn)生的熱量問(wèn)題，并節(jié)約了能源。同樣如果發(fā)酵罐是現(xiàn)成的，將很明顯限制了培養(yǎng)基的選擇。
從實(shí)驗(yàn)室放大到中試規(guī)模，最后到工業(yè)生產(chǎn)，放大效應(yīng)會(huì)產(chǎn)生各種各樣的問(wèn)題。比如實(shí)驗(yàn)室使用的培養(yǎng)基一般黏度較高，而在大型發(fā)酵罐中使用，由于氣液傳遞速率降低，高黏度的培養(yǎng)基顯然要消耗更高的攪拌功率，故要加以調(diào)整。除了能滿足生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成的要求外，培養(yǎng)基的組成也會(huì)影響到pH值的變化、泡沫的形成、氧化還原電位和微生物的形態(tài)。在培養(yǎng)基中，有時(shí)也需要添加前體物質(zhì)或代謝的抑制劑，有時(shí)需加促進(jìn)劑，以促進(jìn)產(chǎn)物的形成。
一、工業(yè)上常用的碳源
在微生物發(fā)酵過(guò)程中，普遍以碳水化合物作為碳源。使用最廣的碳水化合物是玉米淀粉，也可使用其他農(nóng)作物，如大米、馬鈴薯、番薯、木薯淀粉等。淀粉可用酸法或酶法水解產(chǎn)生葡萄糖，滿足生產(chǎn)使用。
大麥經(jīng)發(fā)芽制成麥芽，除了淀粉外，麥芽還含有許多糖分。麥芽是啤酒生產(chǎn)的主要原料或唯一原料，其碳水化合物組成見(jiàn)表3-29。麥芽汁也可由發(fā)芽的其他谷物制備得到。
蔗糖一般來(lái)自甘蔗或甜菜，在發(fā)酵培養(yǎng)基中常用的甜菜或甘蔗糖蜜是在糖精制過(guò)程中留下的殘液。用于生產(chǎn)疫苗的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基，通常是用牛血清蛋白、牛肉汁等蛋白質(zhì)作為碳源。
現(xiàn)在人們對(duì)諸如酒精、簡(jiǎn)單的有機(jī)酸、烷烴等含碳物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中作為碳源越來(lái)越感興趣，雖然它們的價(jià)格比相等數(shù)量的粗碳水化合物要昂貴得多，但由于純度較高，便于發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)物的回收和精制。甲烷、甲醇和烷烴已經(jīng)用于微生物菌體的生產(chǎn)，例如將甲醇作為底物生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白，用烷烴進(jìn)行有機(jī)酸、維生素等的生產(chǎn)。工業(yè)發(fā)酵過(guò)程碳源的選擇主要取決于發(fā)酵的產(chǎn)品，當(dāng)然也會(huì)受到政府法規(guī)等因素的影響。
二、工業(yè)上常用的氮源
工業(yè)生產(chǎn)上所用的微生物都能利用無(wú)機(jī)或有機(jī)氮源，無(wú)機(jī)氮源包括氨水、銨鹽或硝酸鹽等；有機(jī)氮源包括玉米漿(corn steep liquor，CSL)、豆餅粉、花生餅粉、棉籽粉、魚粉、酵母浸出液等。其功能是構(gòu)成菌體成分，作為酶的組成分或維持酶的活性，調(diào)節(jié)滲透壓、pH值、氧化還原電位等。除玉米漿外，還有其他的一些原料如豆餅粉等，它們既能作氮源又能作碳源。表3-30是工業(yè)常用的氮源含氮量。
無(wú)機(jī)鹽
無(wú)機(jī)鹽是微生物生命活動(dòng)所不可缺少的物質(zhì)。其主要功能是構(gòu)成菌體成分、作為酶的組成部分、酶的激活劑或抑制劑、調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓、調(diào)節(jié)pH值和氧化還原電位等。一般微生物所需要的無(wú)機(jī)鹽為硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物和含鉀、鈉、鎂、鐵的化合物。還需要一些微量元素，如銅、錳、鋅、鉬、碘、溴等。微生物對(duì)無(wú)機(jī)鹽的需要量很少，但無(wú)機(jī)鹽含量對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物的生成影響很大。
⒈ 磷酸鹽
磷是某些蛋白質(zhì)和核酸的組成成分。腺二磷(ADP)、腺三磷(ATP)是重要的能量傳遞者，參與一系列的代謝反應(yīng)。磷酸鹽在培養(yǎng)基中還具有緩沖作用。微生物對(duì)磷的需要量一般為0.005～0.01 mol／L。工業(yè)生產(chǎn)上常用K3PO4·3H2O、K3PO4和Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O等磷酸鹽，也可用磷酸。K3PO4·3H2O含磷13.55％，當(dāng)培養(yǎng)基中配用1～1.5 g／L時(shí)，磷濃度為0.0044～0.0066 mol／L。Na2HPO4·12H2O含磷8.7％，當(dāng)培養(yǎng)基中配用1.7～2.0 g／L時(shí)，磷濃度為0.0048～0.00565 mol／L。另外，玉米漿、糖蜜、淀粉水解糖等原料中還有少量的磷。磷酸(H3PO4)含磷為3.16％，當(dāng)培養(yǎng)基中配用0.5～3.7 g／L時(shí)，磷濃度為0.005～0.007 mol／L。如果使用磷酸，應(yīng)先用NaOH或KOH中和后加入。
磷含量對(duì)谷氨酸發(fā)酵影響很大。磷濃度過(guò)高時(shí)，菌體轉(zhuǎn)向合成纈氨酸；但磷含量過(guò)低，菌體生長(zhǎng)不好。
⒉ 硫酸鎂
鎂是某些細(xì)菌的葉綠素的組成分。雖并不參與任何細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)的組成，但它的離子狀態(tài)是許多重要的酶(如己糖磷酸化酶、異檸檬酸脫氫酶、羧化酶等)的激活劑。如果鎂離子含量太少，就影響基質(zhì)的氧化。一般革蘭陽(yáng)性菌對(duì)Mg2+的最低要求量是25 mg／L，革蘭陰性菌為4～5 mg／L。MgSO4·7H2O中含Mg2+ 9.87％，發(fā)酵培養(yǎng)基配用0.25～l g／L時(shí)，Mg2+濃度25～90 mg／L。
硫存在于細(xì)胞的蛋白質(zhì)中，是含硫氨基酸的組成分。硫是構(gòu)成一些酶的活性基。培養(yǎng)基中的硫已在硫酸鎂中供給，不必另加。
⒊ 鉀鹽
鉀不參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)的組成，它是許多酶的激活劑。谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)物生成所需要的鉀鹽比菌體生長(zhǎng)需要量高。菌體生長(zhǎng)需鉀量約為0.1 g／L(以K2SO4計(jì)，以下同)，谷氨酸生成需鉀量為0.2～1.0 g／L。鉀對(duì)谷氨酸發(fā)酵有影響，鉀鹽少長(zhǎng)菌體，鉀鹽足夠產(chǎn)谷氨酸。當(dāng)培養(yǎng)基中配用l g／L K3PO4·3H2O時(shí)，其鉀濃度約為0.38 g／L。如果采用Na2HPO4·12H2O時(shí)，應(yīng)配用0.3～0.6 g／L KCl，鉀濃度為0.35～0.7 g／L。
⒋ 微量元素
還有許多元素，微生物需要量十分微小，但又是不可缺少的，稱為微量元素。例如錳是某些酶的激活劑，羧化反應(yīng)必須有錳參與，如谷氨酸生物合成途徑中，草酰琥珀脫羧生成α-酮戊二醛是在Mn2+存在下完成的。一般培養(yǎng)基配用2 mg／L MnSO4·4H2O。鐵是細(xì)胞色素氧化酶、過(guò)氧化氫酶的成分，又是若干酶的激活劑。
一般作為碳、氮源的農(nóng)副產(chǎn)品天然原料中，本身就含有某些微量元素，不必另加。必須指出，某些金屬離子，特別是汞和銅離子，具有明顯的毒性，抑制菌體生長(zhǎng)和影響谷氨酸的合成，因此，必須避免有害離子加入培養(yǎng)基中。
生長(zhǎng)因子
從廣義來(lái)說(shuō)，凡是微生物生長(zhǎng)不可缺少的微量有機(jī)物質(zhì)，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱為生長(zhǎng)因子。其功能是構(gòu)成細(xì)胞的組成分，促進(jìn)生命活動(dòng)的進(jìn)行。生長(zhǎng)因子不是所有微生物都必需的，它只是對(duì)于某些自己不能合成這些成分的微生物才是必不可少的營(yíng)養(yǎng)物。
目前以糖質(zhì)原料為碳源的谷氨酸產(chǎn)生菌均為生物素缺陷型(biotin auxotroph)，以生物素為生長(zhǎng)因子。有些菌株還可以硫胺素為生長(zhǎng)因子，有些變異株油酸缺陷型以油酸為生長(zhǎng)因子。
⒈ 生物素
生物素的作用主要影響谷氨酸產(chǎn)生菌細(xì)胞膜的通透性，同時(shí)也影響菌體的代謝途徑。生物素濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和谷氨酸積累都有影響，大量合成谷氨酸所需要的生物素濃度比菌體生長(zhǎng)的需要量低，即為菌體生長(zhǎng)需要的“亞適量”。谷氨酸發(fā)酵最適的生物素濃度隨菌種、碳源種類和濃度以及供氧條件不同而異，一般為5 μg／L左右。如果生物素過(guò)量，就大量繁殖而不產(chǎn)或少產(chǎn)谷氨酸，而產(chǎn)乳酸或琥珀酸，在生產(chǎn)中表現(xiàn)為長(zhǎng)菌快，pH值低，尿素消耗多。若生物素不足，菌體生長(zhǎng)不好，谷氨酸產(chǎn)量也低，表現(xiàn)為長(zhǎng)菌慢，耗糖慢，發(fā)酵周期長(zhǎng)。當(dāng)供氧不足，生物素過(guò)量時(shí)，則發(fā)酵向乳酸發(fā)酵轉(zhuǎn)換。供氧充足，生物素過(guò)量，糖代謝傾向于完全氧化。
菌體從培養(yǎng)液中攝取生物素的速度是很快的，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)菌體繁殖所消耗的生物素量，因此，培養(yǎng)液中殘留的生物素量很低，在發(fā)酵過(guò)程中菌體內(nèi)生物素含量由“豐富轉(zhuǎn)向貧乏”過(guò)渡。有人試驗(yàn)得出結(jié)果，當(dāng)菌體內(nèi)生物素從20 μg／g干菌體降到0.5 μg／g干菌體，菌體就停止生長(zhǎng)，繼續(xù)發(fā)酵，在適宜條件下就大量積累谷氨酸。
生物素是B族維生素的一種，又叫做維生素H或輔酶R，生物素是一種弱一元酸(Kα＝6.3×10-8)，在25 ℃時(shí)，在水中的溶解度為22 mg／100 mL，在酒精中為80 mg／100 mL。它的鈉鹽溶解度很大，在酸性或中性水溶液中對(duì)熱較穩(wěn)定。
生物素存在于動(dòng)植物的組織中，多與蛋白質(zhì)呈結(jié)合狀態(tài)存在，用酸水解可以分開(kāi)。生產(chǎn)上可作為生物素來(lái)源的原料及其生物素含量見(jiàn)表3-31。此外，米糠中含量為270 μg／kg，酵母中含量為600～1800 μg／kg，豆餅水解液中含量為120 μg／kg。
⒉ 維生素B1(硫胺素)
維生素B1對(duì)某些谷氨酸菌種的發(fā)酵有促進(jìn)作用。其在水中的溶解度為100 g／100 mL。其1％水溶液的pH值為3.13；0.1％水溶液pH值為3.58。pH值5.5的硫胺素鹽酸鹽水溶液在120 ℃加熱穩(wěn)定，pH值5.5以上易破壞，有氧化劑或還原劑存在時(shí)易失活性。
⒊ 提供生長(zhǎng)因子的農(nóng)副產(chǎn)品原料
⑴ 玉米漿 玉米漿是用亞硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的濃縮物，也是玉米淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)品。
玉米漿的成分因玉米原料來(lái)源及處理方法而變動(dòng)。每批原料變動(dòng)時(shí)均需進(jìn)行小型試驗(yàn)，以確定用量。玉米漿用量還應(yīng)根據(jù)淀粉原料不同，糖濃度及發(fā)酵條件不同而異。一般用量為0.4％～0.8％。雖然玉米漿主要用作氮源，但它含有乳酸、少量還原糖和多糖，含有豐富的氨基酸、核酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽等，因此常用作為提供生長(zhǎng)因子的物質(zhì)。
⑵ 麩皮水解液 可以代替玉米漿，但蛋白質(zhì)、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分比玉米漿少。用量一般為1％(干麩皮計(jì))左右。麩皮水解條件如下：
① 以干麩皮:水: 鹽酸=4.6:26:1配比混合，裝入水解鍋中以0．07～0．08 MPa表壓加熱水解70～80 min。② 以干麩皮:水=1:20，用鹽酸調(diào)pH值1.0，以0.25 MPa表壓加熱水解20 min。然后過(guò)濾取濾液。
⑶ 糖蜜 甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜均可代替玉米漿，但氨基酸等有機(jī)氮含量較低。甘蔗糖蜜用量為0.1％～0.4％。
⑷ 酵母 可用酵母膏、酵母浸出液或直接用酵母粉。
前體物質(zhì)和促進(jìn)劑
隨著原料轉(zhuǎn)換，生產(chǎn)菌種不斷更新，為了進(jìn)一步大幅度提高發(fā)酵產(chǎn)率，在某些工業(yè)發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵培養(yǎng)基除了碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子和水分等五大成分外，考慮到代謝控制方面，還需要添加某些特殊功用的物質(zhì)。這些物質(zhì)加入到培養(yǎng)基中有助于調(diào)節(jié)產(chǎn)物的形成，而并不促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)。例如某些氨基酸、抗生素、核苷酸和酶制劑的發(fā)酵需要添加前體物質(zhì)、促進(jìn)劑、抑制劑及中間補(bǔ)料等。添加這些物質(zhì)往往與菌種特性和生物合成產(chǎn)物的代謝控制有關(guān)，目的在于大幅度提高發(fā)酵產(chǎn)率、降低成本。
⒈ 前體物質(zhì)
某些化合物加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過(guò)程結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)并沒(méi)有多大變化，但產(chǎn)物的量卻因加入而有較大的提高，這類化合物稱為前體物質(zhì)。有些氨基酸、核苷酸和抗生素發(fā)酵必須添加前體物質(zhì)才能獲得較高的產(chǎn)率。例如絲氨酸、色氨酸、異亮氨酸及蘇氨酸發(fā)酵時(shí)，培養(yǎng)基中分別添加各種氨基酸的前體物質(zhì)如甘氨酸、吲哚、2-羥基-4-甲基硫代丁酸、α-氨基丁酸及高絲氨酸等，這樣可避免氨基酸合成途徑的反饋和抑制作用，從而獲得較高的產(chǎn)率。目前應(yīng)用添加前體物質(zhì)的方法大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)絲氨酸在日本已經(jīng)實(shí)現(xiàn)，色氨酸和蛋氨酸的生產(chǎn)也可望工業(yè)化。又如5’-核苷酸可以由糖在加有化學(xué)合成的腺嘌呤為前體物質(zhì)情況下，用腺嘌呤或鳥嘌呤缺陷變異菌株直接發(fā)酵生成。
抗生素合成的前體物質(zhì)在一定條件下可控制生產(chǎn)菌的合成方向和增加抗生素的產(chǎn)量。在青霉素的生產(chǎn)過(guò)程中，人們發(fā)現(xiàn)加入玉米漿后，青霉素的單位提高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)單位增長(zhǎng)的原因是玉米漿中含有苯乙胺?？股匕l(fā)酵常用前體物質(zhì)如表3-34所示。苯乙酸、苯乙硫胺、丙酸均可以在生產(chǎn)過(guò)程中使用，但要注意這些前體加入過(guò)多對(duì)菌體會(huì)產(chǎn)生毒性。因此在發(fā)酵過(guò)程中，加入前體不但可使其青霉素G比例大為增加(占總青霉素量的99％以上)，且使青霉素的產(chǎn)量有所提高(由于前體物質(zhì)的存在，可使培養(yǎng)基的硫酸鹽中的硫原子更多地結(jié)合到青霉素分子中去)。
前體物質(zhì)的利用往往與菌種的特性和菌齡有關(guān)，如兩種青霉素產(chǎn)生菌對(duì)苯乙酸的利用率不同，形成青霉素G的比例也不同，較老的菌絲對(duì)前體的利用較大。前體物質(zhì)愈易被氧化的，用于構(gòu)成青霉菌分子的比例就越少。
一般說(shuō)來(lái)，當(dāng)前體物質(zhì)是合成過(guò)程中的限制因素時(shí)，前體物質(zhì)加入量越多，抗生素產(chǎn)量就越高(見(jiàn)表3-35)。但前體物質(zhì)的濃度越大，利用率越低。在抗生素發(fā)酵中大多數(shù)的前體物質(zhì)對(duì)生產(chǎn)菌體有毒性，故一次加入量不宜過(guò)大。為了避免前體物質(zhì)濃度過(guò)大，一般采取間隙分批添加或連續(xù)滴加的方法加入。
⒉ 發(fā)酵過(guò)程中的促進(jìn)劑和抑制劑
在氨基酸、抗生素和酶制劑發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，可以在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入某些對(duì)發(fā)酵起一定促進(jìn)作用的物質(zhì)，稱為促進(jìn)劑或刺激劑。例如在酶制劑發(fā)酵過(guò)程中，加入某些誘導(dǎo)物、表面活性劑及其他一些產(chǎn)酶促進(jìn)劑，可以大大增加菌體的產(chǎn)酶量。
添加誘導(dǎo)物，對(duì)產(chǎn)誘導(dǎo)酶(如水解酶類)的微生物來(lái)說(shuō)，可使原來(lái)很低的產(chǎn)酶量大幅度地提高，這在生產(chǎn)酶制劑新品種時(shí)尤其明顯。一般的誘導(dǎo)物是相應(yīng)酶的作用底物或一些底物類似物，這些物質(zhì)可以“啟動(dòng)”微生物體內(nèi)的產(chǎn)酶機(jī)構(gòu)，如果沒(méi)有這些物質(zhì)，這種機(jī)構(gòu)通常是沒(méi)有活性的，產(chǎn)酶是受阻抑的。
在培養(yǎng)基中添加微量的促進(jìn)劑可大大地增加某些微生物酶的產(chǎn)量。常用促進(jìn)劑有各種表面活性劑(洗凈劑、吐溫80、植酸等)、二乙胺四乙酸、大豆油抽提物、黃血鹽、甲醇等。如棲土曲霉3942生產(chǎn)蛋白酶時(shí)，在發(fā)酵2～8 h添加0.1％LS洗凈劑(即脂肪酰胺磺酸鈉)，就可使蛋白酶產(chǎn)量提高50％以上。添加占培養(yǎng)基0.02％～1％的植酸鹽可顯著地提高枯草桿菌、假單胞菌、酵母、曲霉等的產(chǎn)酶量。在生產(chǎn)葡萄糖氧化酶時(shí)，加入金屬螯合劑二乙胺四乙酸(EDTA)對(duì)酶的形成有顯著影響，酶活力隨二乙胺四乙酸用量而遞增。又如添加大豆油抽提物，米曲霉蛋白酶可提高187％的產(chǎn)量，脂肪酶可提高150％的產(chǎn)量。在酶制劑發(fā)酵過(guò)程中添加促進(jìn)劑能促進(jìn)產(chǎn)量增加的原因主要是改進(jìn)了細(xì)胞膜的滲透性，同時(shí)增強(qiáng)了氧的傳遞速度，改善了菌體對(duì)氧的有效利用。
抗生素工業(yè)在發(fā)酵過(guò)程中加入某些促進(jìn)劑或抑制劑(見(jiàn)表3-36)，?？纱龠M(jìn)抗生素的生物合成。在不同的情況下，不同的促進(jìn)劑所起的作用也各不相同。有的可能起生長(zhǎng)因子的作用，如加入微量植物刺激劑可促進(jìn)某些放線菌的生長(zhǎng)發(fā)育，縮短發(fā)酵周期或提高抗生素發(fā)酵單位；有的可推遲菌體的自溶，如巴比妥藥物能增加鏈霉素產(chǎn)生菌的菌絲抗自溶能力(巴比妥主要對(duì)鏈霉素生物合成酶系統(tǒng)具有刺激作用)；有的是抑制了某些合成其他產(chǎn)物的途徑而使之向所需產(chǎn)物的途徑轉(zhuǎn)化；有的是降低了生產(chǎn)菌的呼吸，使之有利于抗生素的合成，如在四環(huán)素發(fā)酵中添加硫氰化芐，可降低菌在三羧酸循環(huán)中某些酶活力，而增強(qiáng)戊糖代謝，使之利于四環(huán)素的合成；有的可改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，改善通氣效果，如加入聚乙烯醇、聚丙烯酸鈉、聚二乙胺等水溶性高分子化合物或加入某些表面活性劑后改善了通氣效果，進(jìn)而促進(jìn)發(fā)酵單位提高；有的可與抗生素形成復(fù)鹽，從而降低發(fā)酵液中抗生素的濃度和促進(jìn)抗生素的合成，如在四環(huán)素發(fā)酵中加入N,N-二芐基乙烯二胺(DBED)與四環(huán)素形成復(fù)鹽，促使發(fā)酵向有利于四環(huán)素合成的方向進(jìn)行。
氨基酸發(fā)酵易于發(fā)生的問(wèn)題，一是谷氨酸發(fā)酵時(shí)噬菌體引起的異常發(fā)酵，由于噬菌體有宿主專一性，現(xiàn)在的措施是交替更換菌種或選用抗噬菌體菌株，但噬菌體也可以發(fā)生宿主范圍突變，因此也有采用添加氯霉素、多聚磷酸鹽、植酸等防止；二是賴氨酸發(fā)酵等營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株易發(fā)生回復(fù)突變，現(xiàn)在發(fā)酵時(shí)已采用定時(shí)添加紅霉素而解決。
在發(fā)酵過(guò)程中添加促進(jìn)劑的用量極微，選擇得好，效果較顯著，但一般來(lái)說(shuō)，促進(jìn)劑的專一性較強(qiáng)，往往不能相互套用。
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