乳酸菌是一類能夠發(fā)酵利用糖產生乳酸的細菌統(tǒng)稱。一般乳酸菌不易存活，對環(huán)境的抗逆性差，不能夠耐高溫，耐酸和耐膽鹽，因此乳酸菌制品普遍存在著保存性差、易失活等缺點。
凝結芽孢桿菌是一類能夠形成芽孢的乳酸菌，它除了具有一般乳酸菌的維持腸道微生態(tài)平衡，提高機體消化功能和健康水平外，還具有耐高溫，耐酸、耐膽鹽等優(yōu)點，能有效抑制有害菌的生長，改良腸道微生態(tài)環(huán)境，促進腸道發(fā)育，增強腸道功能，在飼料行業(yè)有很好的應用前景，被美國食品與藥物局（FDA）列入可用于飼料的安全微生物菌種名單。由于凝結芽孢桿菌的芽孢具有易保藏、復活率高等特點，因而是乳酸菌商品化制劑的重要形式。目前如何通過培養(yǎng)條件調控，使凝結芽孢桿菌的產芽孢率提高是研究重點。本文在前期篩選獲得一株凝結芽孢桿菌B2的基礎上，嘗試采用液態(tài)發(fā)酵方式，通過PB試驗設計優(yōu)化其培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件，以期進一步提高凝結芽孢桿菌的產芽孢數，為后期制劑的大規(guī)模生產提供數據依據。
材料與方法
1.1 材料
菌種：凝結芽孢桿菌B2為本實驗室篩選，于-20 ℃保存。
發(fā)酵培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基，成分為葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，加水至1 L，pH值7.0，115 ℃滅菌20 min。
1.2 方法
1.2.1 菌種活化
將保存的菌種轉接到種子培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h,備用。
1.2.2 種子液的制備
從斜面上挑取一環(huán)培養(yǎng)物接種到裝有20 ml 培養(yǎng)液的50 ml 三角瓶中，于30 ℃、220 r/min條件下震蕩培養(yǎng)24 h，備用。
1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)
將上述種子培養(yǎng)液按1%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量100 ml，于30 ℃、220 r/min條件下搖瓶培養(yǎng)48 h。
1.2.4 培養(yǎng)基的單因素試驗
首先通過PB試驗確定影響芽孢得率的顯著培養(yǎng)基成分，再通過對顯著成分的單因素試驗，確定其最佳添加量。
1.2.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化
在獲得最佳培養(yǎng)基的基礎上，對接種量以及發(fā)酵模式（震蕩、靜置）進行逐一優(yōu)化。
1.2.6 計數方法
凝結芽孢桿菌的活菌總數采用稀釋平板計數法；芽孢計數則采用把培養(yǎng)后菌液于80 ℃水浴15 min后稀釋涂平板計數。
結果與分析
2.1 不同培養(yǎng)原料對液體發(fā)酵產芽孢能力的影響
在試驗過程中發(fā)現凝結芽孢桿菌B2在若干培養(yǎng)基平板上有產芽孢的能力，其中以加入淀粉的平板產芽孢最早，在24 h產生，以加入蛋白胨的平板為最高，因此，綜合考慮，我們選擇幾種工業(yè)上發(fā)酵罐中常用的碳氮源作為PB實驗的篩選因子。
由表2可知，試驗模型的R2值為0.91，表明實驗有91%的數據能夠用此模型擬合，模型情況較好。Shapiro-Wilktest表明數據符合正態(tài)分布。同時各因素的作用顯著性排序為：蛋白胨>淀粉>大豆粉>葡萄糖>酵母膏>K2HPO4>(NH4)2SO4。其中顯著的因素為蛋白胨、大豆粉和淀粉。
2.2 凝結芽孢桿菌芽孢形成培養(yǎng)基的確定
根據2.1 節(jié)所獲得的結果，我們選擇了蛋白胨、淀粉和大豆粉等3個因素為考察對象，其余因素取低水平。對此3因素進行單因素實驗，摸索它們的最佳添加量。
淀粉最佳的添加量為0.2%、蛋白胨最佳添加量為0.5%、大豆粉最佳添加量為1.0%，結合2.1節(jié)的結果，確定凝結芽孢桿菌發(fā)酵產芽孢的最佳培養(yǎng)基為淀粉0.2%、蛋白胨0.5%、大豆粉1.0%、葡萄糖0.1%、酵母膏0.07%、MnSO40.02%。
2.3 接種量的單因素實驗
在確定發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，進一步研究了初始種子接種量對發(fā)酵后芽孢數的影響。
隨著初始種子接種量的增加，發(fā)酵后的芽孢數量也逐步提高，考慮到生產實際，合理的接種量應該控制在3%~5%。
2.4 不同的培養(yǎng)方式對凝結芽孢桿菌芽孢得率的影響
研究表明，提高通氣量有助于凝結芽孢桿菌轉變?yōu)檠挎?，而靜置培養(yǎng)又可提高初始菌數。因此我們選取了3種不同的作用方式。最佳的培養(yǎng)方式為連續(xù)搖瓶的方式，在此條件下，芽孢數量可以達到3.5×108 cfu/ml。
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