微生物菌種保存常見失誤與規(guī)范操作指南及標(biāo)準(zhǔn)化建議！
小楊 / 2026-01-06 10:13:27
一、菌種標(biāo)識不規(guī)范導(dǎo)致的混淆與污染
錯誤操作：依賴記憶或臨時標(biāo)記，未規(guī)范書寫標(biāo)簽，導(dǎo)致后續(xù)無法辨認(rèn)菌種信息，甚至因污染造成實(shí)驗(yàn)延誤。
后果：
1、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不可靠，需重復(fù)驗(yàn)證，延誤項(xiàng)目進(jìn)度；
2、若誤用污染菌種進(jìn)行質(zhì)粒提取等操作，可能導(dǎo)致遺傳材料丟失。
規(guī)范操作：
1、標(biāo)簽應(yīng)包含菌種名稱（含菌株號）、保存日期、保存人姓名；
2、使用防水記號筆書寫，并用透明膠帶纏繞加固，防止低溫環(huán)境下字跡模糊或脫落；
3、建議結(jié)合電子臺賬記錄，實(shí)現(xiàn)菌種信息可追溯。
二、凍存管破裂與樣本污染
錯誤操作：將未預(yù)留空間的菌液直接置于-80℃冷凍，導(dǎo)致液體膨脹凍存管破裂。
科學(xué)原理：水在凍結(jié)時體積膨脹約9%，密封容器內(nèi)部壓力驟增，引起破裂。
風(fēng)險：
1、樣本泄漏造成交叉污染；
2、增加實(shí)驗(yàn)室生物安全隱患，尤其涉及病原微生物時；
3、清理污染耗時且可能損壞冰箱其他樣本。
規(guī)范操作：
1、分裝菌液時預(yù)留至少1/3空間；
2、采用梯度冷凍法：先將凍存管置于-20℃ 1-2小時，再轉(zhuǎn)移至-80℃長期保存；
3、定期檢查凍存管密封性，使用耐低溫高質(zhì)量凍存管。
三、反復(fù)凍融導(dǎo)致菌種活性喪失
錯誤操作：同一凍存管多次取用，反復(fù)凍融。
科學(xué)原理：冰晶反復(fù)形成會破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷及活性下降。研究表明，多數(shù)細(xì)菌經(jīng)3次以上凍融后存活率顯著降低。
規(guī)范操作：
1、保存前將菌液分裝為單次使用量（如每管100-200 µL）；
2、取用后剩余菌液不建議再次凍存；
3、建立菌種使用記錄，避免重復(fù)開啟同一凍存管。
四、甘油保存液濃度不當(dāng)
錯誤操作：甘油濃度配制隨意，或使用已氧化的甘油溶液。
影響機(jī)制：
濃度過高（>30%）：滲透壓導(dǎo)致細(xì)胞脫水死亡；
濃度過低（<15%）：保護(hù)不足，低溫下冰晶損傷細(xì)胞；
甘油氧化產(chǎn)物（如丙烯醛）對微生物有毒性。
規(guī)范操作：
1、依據(jù)菌種特性選擇適宜濃度（通常為15-30%）；
2、使用高純度無菌甘油，現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長期存放；
3、推薦配制60%甘油母液，與菌液等體積混合，最終濃度為30%。
五、長期保存后未驗(yàn)證活性
錯誤操作：認(rèn)為菌種保存后即可永久存活，未定期復(fù)蘇檢驗(yàn)。
潛在風(fēng)險：
1、冰箱溫度波動、停電等意外可導(dǎo)致菌種失活；
2、部分菌株長期靜止保存后可能出現(xiàn)表型變異或退化。
規(guī)范操作：
1、每3-6個月復(fù)蘇一次凍存菌種，通過平板劃線或液體培養(yǎng)驗(yàn)證活性；
2、重要菌株應(yīng)多途徑備份（如-80℃甘油菌、斜面、凍干保存等）；
3、建立菌種庫存管理清單，標(biāo)注保存位置及復(fù)蘇記錄。
六、菌種保存標(biāo)準(zhǔn)化操作建議
1、材料準(zhǔn)備：專用凍存管、無菌甘油、標(biāo)簽、微量移液器及滅菌吸頭。
2、流程標(biāo)準(zhǔn)化：
取對數(shù)生長期菌液，與無菌甘油按比例混合；
分裝、標(biāo)記、梯度冷凍后轉(zhuǎn)移至-80℃；
詳細(xì)記錄保存信息并錄入數(shù)據(jù)庫。
3、安全原則：
涉及致病菌須在相應(yīng)生物安全等級下操作；
定期清理過期樣本，避免冰箱擁擠及污染風(fēng)險。
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