鴨胚成纖維細胞永生化抗原轉(zhuǎn)染實驗的具體操作步驟！
小楊 / 2025-12-13 09:43:02
百歐博偉生物：目前
鴨胚成纖維細胞永生化多通過慢病毒介導 SV40 大 T 抗原轉(zhuǎn)染實現(xiàn)，該方法轉(zhuǎn)化效率高且細胞穩(wěn)定性好，具體操作步驟圍繞載體構建、病毒包裝、細胞轉(zhuǎn)染篩選等核心環(huán)節(jié)展開，詳細流程如下：
前期準備：原代鴨胚成纖維細胞分離培養(yǎng)
選取 10 日齡左右健康鴨胚，在超凈工作臺內(nèi)無菌取出鴨胚，去除頭部、內(nèi)臟等部位，僅保留軀干組織。
用無菌剪刀將軀干剪碎成 1 - 2cm³ 的組織塊，加入少量含 5% 胎牛血清的 MEM 培養(yǎng)基，吹打分散組織塊后，用 300 目細胞篩網(wǎng)過濾去除大塊雜質(zhì)。
將過濾后的細胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶，置于 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。靜置 6h 后棄去未貼壁的細胞及上清，補加新鮮培養(yǎng)基，待細胞長成單層后，用 0.25% 胰蛋白酶消化傳代，持續(xù)培養(yǎng)至 5 - 10 代，獲得狀態(tài)穩(wěn)定的原代鴨胚成纖維細胞備用。
核心環(huán)節(jié)一：構建 SV40 大 T 抗原慢病毒表達載體
PCR 擴增目的基因：以含 SV40 大 T 抗原 cDNA 序列的 sv40tsa58 質(zhì)粒為模板，依據(jù) SV40 完整基因組設計特異性引物。配置 50μl 高保真 PCR 反應體系，包含引物混合液 1.5μl、10×PfU DNA 聚合酶反應混合物 5μl、PfU DNA 聚合酶 0.5μl、模板 DNA 質(zhì)粒 1μl，剩余用滅菌去離子水補齊。反應程序設定為 95℃預變性 2min；95℃15s、58℃30s、68℃4min，循環(huán) 36 次；最后 68℃延伸 5min，擴增得到 SV40 大 T 抗原全長 cDNA 并純化產(chǎn)物。
載體重組構建：將純化后的 PCR 產(chǎn)物通過 Topo 克隆接入 pENTR™TOPO 載體，得到 pENTR - SV40T 質(zhì)粒。隨后進行 LR 重組反應，在 1.5ml 離心管中加入 7μl pENTR - SV40T 質(zhì)粒、1μl 目標慢病毒載體、8μl TE 緩沖液及 2μl LR Clonase™II 酶混合物，25℃孵育 1h 后，加 1μl 蛋白酶 k 溶液終止反應，37℃孵育 10min，最終構建出 SV40 大 T 抗原慢病毒表達載體。
核心環(huán)節(jié)二：慢病毒包裝
選取 293FT 工程細胞作為包裝細胞，提前接種到培養(yǎng)瓶中，待細胞匯合度達 70% - 80% 時進行轉(zhuǎn)染。
采用脂質(zhì)體 Lipofectamine™2000 介導，將構建好的 SV40 大 T 抗原慢病毒表達載體，與包裝質(zhì)粒 pCMV - VSV - G 和 pSPAX2 共同轉(zhuǎn)染 293FT 細胞。
轉(zhuǎn)染后置于 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 - 72h，收集細胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)離心、過濾去除細胞碎片，獲得含 SV40 大 T 抗原的重組慢病毒液，可進一步濃縮處理以提高病毒滴度。
核心環(huán)節(jié)三：慢病毒轉(zhuǎn)染原代鴨胚成纖維細胞
將前期培養(yǎng)好的原代鴨胚成纖維細胞接種到 6 孔板中，每孔細胞數(shù)約 2×10?個，培養(yǎng)至細胞匯合度達 50% - 60%。
去除孔內(nèi)舊培養(yǎng)基，加入適量稀釋后的重組慢病毒液，同時可添加少量聚凝胺以提高轉(zhuǎn)染效率，置于培養(yǎng)箱中孵育 6 - 10h。
孵育結束后，棄去含病毒的培養(yǎng)液，更換為新鮮的含 5% 胎牛血清的 MEM 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 24 - 48h。
篩選與純化：獲得穩(wěn)定永生化細胞
當轉(zhuǎn)染后的細胞匯合度接近 80% 時，按 1:5 比例傳代培養(yǎng)。待細胞密度達 50% - 70%，向培養(yǎng)基中加入博來霉素或 G418 等篩選藥物（濃度依據(jù)預實驗確定，如 G418 可設 400μg/mL）。
持續(xù)培養(yǎng)并定期更換含篩選藥物的新鮮培養(yǎng)基，去除未成功轉(zhuǎn)染的細胞，約 1 - 2 周后可出現(xiàn)抗性細胞克隆。
采用濾紙法分離單個抗性克隆，將其接種到新的培養(yǎng)孔中擴大培養(yǎng)。后續(xù)可通過免疫熒光檢測 SV40 大 T 抗原的表達，確認轉(zhuǎn)染成功。
永生化驗證與凍存
進行傳代對比實驗，觀察細胞能否長期穩(wěn)定傳代，同時與未轉(zhuǎn)染的原代細胞對比，驗證其是否突破分裂限制；還可通過核型分析檢測細胞染色體穩(wěn)定性。
選取狀態(tài)良好的永生化細胞進行凍存，棄去培養(yǎng)基后用 PBS 清洗 1 - 2 次，加入胰酶消化，隨后用完全培養(yǎng)基終止消化。1000rpm 離心 5min，棄上清后用含 10% DMSO 的胎牛血清重懸細胞，分裝到凍存管中，經(jīng)程序降溫盒放入 - 80℃冰箱過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮長期保存。
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