胰化大豆堅固綠瓊脂的核心原理與使用流程及實驗現(xiàn)象！
小楊 / 2025-12-08 09:21:10
胰化大豆堅固綠瓊脂（Tryptic Soy Fast Green Agar，TSFGA）是一種選擇性兼鑒別培養(yǎng)基，核心用于分離和鑒別革蘭氏陰性菌（尤其腸桿菌科），通過堅固綠（Fast Green）染料的選擇性抑制作用和發(fā)酵代謝產(chǎn)物的顯色反應(yīng)實現(xiàn)目標(biāo)菌篩選。以下從核心原理、使用流程、實驗現(xiàn)象判讀、適用場景、質(zhì)量控制及常見問題展開詳細(xì)說明，兼顧實驗操作規(guī)范性與結(jié)果解讀準(zhǔn)確性：
一、核心原理
1、培養(yǎng)基成分與功能（典型配方）
成分 功能
胰化大豆胨 提供碳源、氮源、維生素及生長因子，支持多數(shù)細(xì)菌（革蘭氏陰/陽性）基礎(chǔ)生長
氯化鈉 維持滲透壓平衡
瓊脂 凝固劑（濃度 1.5%-1.8%，保證培養(yǎng)基硬度）
堅固綠（Fast Green FCF） 選擇性抑制劑：低濃度（通常 0.001%-0.005%）抑制革蘭氏陽性菌生長，對革蘭氏陰性菌毒性較低
發(fā)酵底物（可選，如乳糖、葡萄糖） 鑒別依據(jù)：發(fā)酵型革蘭氏陰性菌分解底物產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基 pH 下降，堅固綠顏色發(fā)生變化
緩沖劑 穩(wěn)定培養(yǎng)基初始 pH（通常 7.2-7.4），避免非特異性顯色
2、選擇性與鑒別機(jī)制
選擇性：堅固綠是一種酸性染料，可與革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的肽聚糖結(jié)合，干擾其細(xì)胞壁合成或代謝，從而抑制生長；革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁肽聚糖層薄，且有外膜屏障，對染料耐受性更強(qiáng)，可正常生長。
鑒別性：若培養(yǎng)基添加發(fā)酵底物，發(fā)酵型革蘭氏陰性菌（如
大腸桿菌）會產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基局部 pH 降低，堅固綠在酸性條件下顏色由藍(lán)綠色變?yōu)辄S綠色或黃色；非發(fā)酵型革蘭氏陰性菌（如
銅綠假單胞菌）不產(chǎn)酸，菌落仍為藍(lán)綠色或培養(yǎng)基顏色不變。
二、使用流程（實驗操作規(guī)范）
1、培養(yǎng)基制備
稱量：按配方比例稱取胰化大豆胨、氯化鈉、瓊脂、堅固綠及發(fā)酵底物（若有），加入適量去離子水（如 1L 配方加 950mL 水）。
溶解：加熱煮沸并不斷攪拌，使所有成分完全溶解（避免瓊脂結(jié)塊），補(bǔ)加水至最終體積（1L）。
調(diào) pH：冷卻至 50-60℃時，用 1mol/L HCl 或 NaOH 調(diào) pH 至 7.2-7.4（pH 偏差會影響選擇性和顯色效果）。
滅菌：121℃高壓蒸汽滅菌 15 分鐘（避免滅菌時間過長導(dǎo)致成分降解，堅固綠耐熱性較好，但需避免反復(fù)滅菌）。
倒平板：滅菌后冷卻至 45-50℃（避免溫度過高殺死待檢菌，或過低導(dǎo)致瓊脂凝固），在無菌操作臺上倒入無菌培養(yǎng)皿（每皿約 20mL），水平放置待凝固（約 30 分鐘），備用（可 4℃冷藏保存 1 周內(nèi)使用）。
2、樣品接種與培養(yǎng)
樣品處理：待檢樣品（如食品勻漿、環(huán)境水樣）可直接劃線接種，或經(jīng)梯度稀釋后涂布（若需計數(shù)）。
接種方法：采用無菌劃線法（分離單菌落）或涂布法（菌落計數(shù)），確保接種量適中（劃線法每皿約 10μL，涂布法每皿 0.1mL）。
培養(yǎng)條件：35-37℃有氧培養(yǎng) 18-24 小時（多數(shù)腸桿菌科細(xì)菌最適生長溫度，若培養(yǎng)時間過長，非發(fā)酵菌可能過度生長掩蓋目標(biāo)菌）。
3、結(jié)果觀察與記錄
觀察菌落形態(tài)（大小、形狀、邊緣、透明度）、顏色，及培養(yǎng)基顏色變化，結(jié)合革蘭氏染色和生化鑒定進(jìn)一步確認(rèn)。
三、實驗現(xiàn)象判讀（關(guān)鍵鑒別標(biāo)準(zhǔn)）
1、革蘭氏陰性菌（目標(biāo)菌，可生長）
細(xì)菌類型 菌落顏色 培養(yǎng)基顏色變化 典型菌株示例
乳糖發(fā)酵型 黃綠色/黃色 菌落周圍培養(yǎng)基變黃 大腸桿菌（E. coli）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）
乳糖非發(fā)酵型 藍(lán)綠色/深綠色 無明顯變化（或微藍(lán)） 銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）、鮑曼不動桿菌（A. baumannii）
弱發(fā)酵型 淺綠色/淺黃綠色 局部輕微變黃 奇異變形桿菌（P. mirabilis）
2、革蘭氏陽性菌（被抑制，不生長或微弱生長）
多數(shù)革蘭氏陽性菌（如
金黃色葡萄球菌、
枯草芽孢桿菌、
鏈球菌）在 TSFGA 上幾乎不生長，或僅形成微小、透明、邊緣不整齊的菌落（生長受抑制），無明顯顯色反應(yīng)。
3、典型菌落特征示例
大腸桿菌：菌落圓形、光滑、濕潤，直徑 2-3mm，呈黃綠色，周圍培養(yǎng)基變黃（強(qiáng)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸）。
銅綠假單胞菌：菌落不規(guī)則、邊緣粗糙，呈藍(lán)綠色，有金屬光澤（產(chǎn)生綠膿素），培養(yǎng)基顏色不變。
肺炎克雷伯菌：菌落大而黏稠（黏液型），呈黃色，周圍培養(yǎng)基明顯變黃（強(qiáng)發(fā)酵乳糖）。
四、適用場景與局限性
1、主要應(yīng)用
食品微生物檢測：篩查食品（如肉類、乳制品、飲用水）中的革蘭氏陰性腐敗菌或致病菌（如
沙門氏菌、
志賀菌，需結(jié)合進(jìn)一步生化鑒定）。
環(huán)境微生物監(jiān)測：檢測水體、土壤中的革蘭氏陰性菌污染情況，評估環(huán)境衛(wèi)生狀況。
2、局限性
無法區(qū)分革蘭氏陰性菌中的具體菌種（如
大腸桿菌與
沙門氏菌均為乳糖發(fā)酵型，需通過生化試驗進(jìn)一步鑒別）。
部分革蘭氏陽性菌（如某些芽孢桿菌）對堅固綠耐受性較強(qiáng)，可能出現(xiàn)微弱生長，需結(jié)合革蘭氏染色排除。
發(fā)酵底物的選擇影響鑒別范圍（如僅含葡萄糖的配方無法區(qū)分乳糖發(fā)酵型與非發(fā)酵型，需根據(jù)檢測目的調(diào)整配方）。
五、質(zhì)量控制（確保實驗可靠性）
1、無菌性檢查
制備好的培養(yǎng)基平板需隨機(jī)抽取 1-2 皿，35-37℃培養(yǎng) 24 小時，若無菌落生長，說明滅菌合格；若有雜菌生長，需重新制備。
2、選擇性驗證
3、鑒別性驗證
4、物理性狀檢查
培養(yǎng)基凝固后應(yīng)均勻、無氣泡、無沉淀，硬度適中（倒置平板不流淌），pH 在 7.2-7.4 之間（可通過 pH 試紙或 pH 計檢測）。
六、常見問題與排查
1、革蘭氏陽性菌生長過多（選擇性失效）
可能原因：堅固綠濃度過低；滅菌時間過長導(dǎo)致染料分解；培養(yǎng)基 pH 過高（>7.5）。
排查方法：調(diào)整堅固綠濃度至 0.003%-0.005%；嚴(yán)格控制滅菌條件（121℃/15 分鐘）；重新調(diào) pH 至 7.2-7.4。
2、顯色不明顯（鑒別性差）
可能原因：發(fā)酵底物添加不足；培養(yǎng)時間過短（<18 小時）；pH 偏差（過酸或過堿）；目標(biāo)菌為弱發(fā)酵型。
排查方法：增加發(fā)酵底物濃度；延長培養(yǎng)至 24 小時；校正培養(yǎng)基 pH；結(jié)合生化試驗進(jìn)一步確認(rèn)。
3、培養(yǎng)基凝固不良
可能原因：瓊脂添加量不足（<1.5%）；滅菌時瓊脂未完全溶解；倒平板時溫度過高導(dǎo)致瓊脂凝固延遲。
排查方法：調(diào)整瓊脂濃度至 1.5%-1.8%；加熱溶解時充分?jǐn)嚢?；冷卻至 45-50℃再倒平板。
4、菌落形態(tài)異常（如干燥、細(xì)?。?/strong>
可能原因：胰化大豆胨含量不足（營養(yǎng)不夠）；培養(yǎng)溫度過低；樣品接種量過少。
排查方法：確保胰化大豆胨濃度≥1.5%；嚴(yán)格控制培養(yǎng)溫度 35-37℃；調(diào)整接種量（劃線法可增加樣品量）。
七、總結(jié)
胰化大豆堅固綠瓊脂的核心價值的是快速分離革蘭氏陰性菌并初步鑒別發(fā)酵型與非發(fā)酵型，操作簡便、選擇性強(qiáng)，適用于臨床、食品、環(huán)境等領(lǐng)域的微生物篩查。實驗關(guān)鍵在于控制培養(yǎng)基 pH、堅固綠濃度及培養(yǎng)條件，結(jié)果判讀需結(jié)合菌落顏色、培養(yǎng)基變化及革蘭氏染色，必要時通過生化鑒定確認(rèn)菌種。通過規(guī)范質(zhì)量控制和問題排查，可顯著提高實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
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