微生物菌種退化與復(fù)壯的原因、檢測(cè)與復(fù)壯方法及預(yù)防措施！
小楊 / 2025-11-21 11:19:32
百歐博偉生物：在微生物發(fā)酵、科研及工業(yè)生產(chǎn)中，菌種的穩(wěn)定性直接決定產(chǎn)品質(zhì)量與效率。菌種退化是普遍存在的現(xiàn)象，而菌種復(fù)壯則是維持菌種優(yōu)良性狀的關(guān)鍵技術(shù)手段。以下從概念、原因、檢測(cè)、復(fù)壯方法及預(yù)防措施五個(gè)維度，系統(tǒng)解析菌種的退化與復(fù)壯。
一、核心概念：什么是菌種退化與復(fù)壯？
1、菌種退化（Strain Degeneration）
指微生物菌種在長(zhǎng)期傳代、保藏或培養(yǎng)過程中，其原有優(yōu)良性狀逐漸減弱或消失，甚至出現(xiàn)有害性狀的現(xiàn)象。退化并非突然發(fā)生，而是一個(gè)漸進(jìn)的、可累積的過程，初期可能僅表現(xiàn)為性狀波動(dòng)，后期則會(huì)嚴(yán)重影響應(yīng)用價(jià)值。常見退化表現(xiàn)：
生產(chǎn)性能下降：如抗生素產(chǎn)量降低、酒精發(fā)酵轉(zhuǎn)化率下降；
形態(tài)結(jié)構(gòu)改變：如細(xì)菌芽孢率降低、真菌菌絲體畸形、菌落顏色/大小變異；
生理特性異常：如生長(zhǎng)速度變慢、耐溫/耐酸能力減弱、營(yíng)養(yǎng)需求改變。
2、菌種復(fù)壯（Strain Rejuvenation）
指通過人工干預(yù)手段，恢復(fù)或強(qiáng)化退化菌種原有優(yōu)良性狀，使菌種回到穩(wěn)定、高效狀態(tài)的技術(shù)過程。復(fù)壯的核心是“篩選優(yōu)良個(gè)體 + 排除退化細(xì)胞”，并非簡(jiǎn)單“恢復(fù)”，有時(shí)還能通過篩選獲得比原始菌種更優(yōu)的突變株。
二、菌種退化的根本原因：遺傳變異與環(huán)境誘導(dǎo)
菌種退化的本質(zhì)是遺傳物質(zhì)的改變（基因突變、基因重組） 與環(huán)境因素的選擇壓力共同作用的結(jié)果，具體可分為兩大類：
（一）遺傳因素：退化的內(nèi)在根源
基因突變（最主要原因）微生物在繁殖過程中（尤其是無性繁殖，如細(xì)菌二分裂、真菌孢子繁殖），DNA 復(fù)制可能發(fā)生隨機(jī)錯(cuò)誤，導(dǎo)致基因突變。
若突變發(fā)生在控制“優(yōu)良性狀”的關(guān)鍵基因，可能直接導(dǎo)致性狀減弱；
例如：產(chǎn)青霉素的青霉菌，若控制青霉素合成的關(guān)鍵酶基因發(fā)生突變，會(huì)導(dǎo)致青霉素產(chǎn)量顯著下降。
基因重組與質(zhì)粒丟失部分細(xì)菌的優(yōu)良性狀由質(zhì)粒（獨(dú)立于染色體的環(huán)狀 DNA）控制。長(zhǎng)期傳代中，質(zhì)粒可能因復(fù)制不穩(wěn)定而丟失，導(dǎo)致性狀退化。
異核體或多核細(xì)胞的分離某些真菌（如
曲霉、
青霉）的菌絲體為多核細(xì)胞，或不同基因型的菌絲融合形成“異核體”。傳代時(shí)，若含優(yōu)良基因型的細(xì)胞核比例降低，或僅分離出劣性基因型的單核孢子，會(huì)導(dǎo)致群體性狀退化。
（二）環(huán)境因素：退化的外在誘因
環(huán)境因素不會(huì)直接導(dǎo)致基因突變，但會(huì)加速突變積累或篩選出退化菌株，具體包括：
培養(yǎng)條件不適：如溫度過高/過低（誘導(dǎo) DNA 損傷）、營(yíng)養(yǎng)缺乏（如氮源不足導(dǎo)致產(chǎn)蛋白菌株退化）、pH 波動(dòng)（影響酶活性及基因表達(dá)）；
傳代次數(shù)過多：每次傳代都會(huì)增加基因突變概率，且“退化菌株可能因生長(zhǎng)速度快而在群體中逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)”；
保藏條件不當(dāng)：如低溫保藏時(shí)冷凍保護(hù)劑失效、干燥保藏時(shí)水分回升，導(dǎo)致菌種代謝紊亂，加速性狀變異；
污染影響：若培養(yǎng)過程中混入雜菌，雜菌可能與目標(biāo)菌種競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)，或分泌有害物質(zhì)抑制目標(biāo)菌種，間接導(dǎo)致其性狀退化。
三、菌種退化的早期檢測(cè)：如何及時(shí)發(fā)現(xiàn)退化？
菌種退化初期癥狀不明顯，需通過定期、多維度檢測(cè)才能及時(shí)發(fā)現(xiàn)，避免造成生產(chǎn)損失。常用檢測(cè)方法如下：
檢測(cè)維度 檢測(cè)指標(biāo)與方法
形態(tài)學(xué)檢測(cè) 觀察菌落形態(tài)（顏色、大小、邊緣、透明度）、細(xì)胞形態(tài)（是否畸形、芽孢率、孢子數(shù)量），與原始菌種對(duì)比；例：
枯草芽孢桿菌若芽孢率從 90% 降至 50%，可能已退化。
生理生化檢測(cè) 測(cè)定生長(zhǎng)速度、營(yíng)養(yǎng)利用能力、抗逆性（耐溫、耐鹽、pH 耐受范圍）；例：
釀酒酵母若發(fā)酵液中酒精濃度下降 5%，需警惕退化。
生產(chǎn)性能檢測(cè) 直接測(cè)定核心生產(chǎn)性狀：如抗生素產(chǎn)量、酶活、產(chǎn)物純度；這是判斷退化的“金標(biāo)準(zhǔn)”，需與原始菌種的生產(chǎn)數(shù)據(jù)對(duì)比。
分子生物學(xué)檢測(cè) 通過 PCR 擴(kuò)增關(guān)鍵基因、測(cè)序驗(yàn)證基因序列是否突變，或用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qPCR）檢測(cè)關(guān)鍵基因的表達(dá)量；可從分子水平早期發(fā)現(xiàn)遺傳變異，靈敏度最高。
四、菌種復(fù)壯的關(guān)鍵方法：從“篩選”到“優(yōu)化”
復(fù)壯需根據(jù)菌種類型（細(xì)菌、真菌、放線菌）及退化程度選擇合適方法，核心思路是“分離優(yōu)良單菌落 + 強(qiáng)化優(yōu)良性狀”，常見方法分為以下四類：
1、純種分離法：排除退化菌株，篩選優(yōu)良個(gè)體
這是最基礎(chǔ)、最常用的復(fù)壯方法，適用于“群體中仍存在少量?jī)?yōu)良菌株”的情況。
步驟：
取退化菌種的培養(yǎng)物，用無菌水梯度稀釋；
將稀釋液涂布在固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后挑取形態(tài)、大小與原始菌種一致的單菌落（排除形態(tài)變異的退化菌落）；
對(duì)挑取的單菌落進(jìn)行“生產(chǎn)性能檢測(cè)”，篩選出性能最優(yōu)的菌株，作為復(fù)壯后的菌種。
適用場(chǎng)景：細(xì)菌（如
大腸桿菌）、酵母菌、放線菌的輕度退化。
2、誘發(fā)突變法：誘導(dǎo)基因突變，篩選超級(jí)菌株
若退化嚴(yán)重（優(yōu)良菌株極少），可通過人工誘導(dǎo)突變，增加“優(yōu)良突變株”的概率，再結(jié)合篩選獲得復(fù)壯菌種。
常用誘變劑：
物理誘變：紫外線（UV）、X 射線、γ 射線（誘導(dǎo) DNA 鏈斷裂或堿基替換）；
化學(xué)誘變：亞硝酸（修飾堿基）、乙基甲磺酸（EMS，烷化劑，誘導(dǎo)點(diǎn)突變）；
生物誘變：噬菌體（介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移）、轉(zhuǎn)座子（插入基因?qū)е峦蛔儯?/div>
示例：產(chǎn)糖化酶的黑曲霉退化后，用紫外線誘變處理孢子，再篩選糖化酶活性比退化菌株高 30% 以上的突變株，實(shí)現(xiàn)復(fù)壯。
3、原生質(zhì)體融合法：結(jié)合優(yōu)良基因型
適用于“兩種近緣菌株分別保留不同優(yōu)良性狀”的情況，通過融合兩者的原生質(zhì)體（去除細(xì)胞壁的細(xì)胞），獲得兼具兩種優(yōu)良性狀的重組菌株。
步驟：
用溶菌酶（細(xì)菌）或纖維素酶（真菌）去除兩菌株的細(xì)胞壁，獲得原生質(zhì)體；
用 PEG（聚乙二醇）誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，培養(yǎng)后篩選融合子；
檢測(cè)融合子的生產(chǎn)性能，選擇最優(yōu)菌株作為復(fù)壯菌種。
優(yōu)勢(shì)：可突破物種界限，快速整合優(yōu)良性狀。
4、宿主體內(nèi)復(fù)壯法：利用宿主環(huán)境篩選毒力/活性菌株
主要適用于寄生性微生物（如病原細(xì)菌、真菌，或與宿主共生的微生物），其優(yōu)良性狀需在宿主體內(nèi)才能表達(dá)，體外培養(yǎng)易退化。
示例：
蘇云金桿菌體外傳代后毒力下降，可將其注射到敏感昆蟲體內(nèi)，存活下來的 Bt 菌株毒力會(huì)顯著恢復(fù)，再?gòu)睦ハx尸體中分離純化，實(shí)現(xiàn)復(fù)壯；
根瘤菌（與豆科植物共生固氮）退化后，可接種到豆科植物根部，篩選固氮能力強(qiáng)的根瘤菌菌株。
五、菌種退化的預(yù)防措施：比復(fù)壯更重要的“源頭控制”
復(fù)壯是“事后補(bǔ)救”，而預(yù)防退化才是維持菌種穩(wěn)定性的核心，可從以下 5 個(gè)環(huán)節(jié)入手：
減少傳代次數(shù)
生產(chǎn)中采用“一次傳代多批次使用”的策略，避免反復(fù)傳代；
建立“菌種三級(jí)保藏體系”：原始菌種（長(zhǎng)期保藏，不用于生產(chǎn)）→ 一級(jí)種子（短期保藏，用于擴(kuò)繁）→ 二級(jí)種子（生產(chǎn)用），嚴(yán)格控制各級(jí)種子的傳代次數(shù)（通常≤5 代）。
優(yōu)化保藏條件根據(jù)菌種特性選擇合適的保藏方法，降低代謝活性，減少基因突變：
長(zhǎng)期保藏：液氮超低溫保藏（-196℃，適用于所有微生物）、冷凍干燥保藏（適用于細(xì)菌、酵母菌）；
短期保藏：4℃斜面保藏（不超過 1 個(gè)月）、-20℃甘油管保藏（不超過 6 個(gè)月）；
保藏時(shí)添加保護(hù)劑（如甘油、蔗糖），避免細(xì)胞損傷。
控制培養(yǎng)條件嚴(yán)格模擬菌種的“最適生長(zhǎng)環(huán)境”：
固定培養(yǎng)基配方（如產(chǎn)酶菌種需添加特定誘導(dǎo)物，如淀粉誘導(dǎo)淀粉酶產(chǎn)生）；
穩(wěn)定培養(yǎng)參數(shù)（溫度、pH、溶氧量、通氣量），避免劇烈波動(dòng)；
定期檢測(cè)培養(yǎng)基無菌性，防止雜菌污染。
定期純化與篩選即使未發(fā)現(xiàn)明顯退化，也需每 3~6 個(gè)月對(duì)菌種進(jìn)行一次“純種分離 + 性能檢測(cè)”，及時(shí)淘汰潛在的退化菌株，保留優(yōu)良個(gè)體。
基因水平穩(wěn)定化對(duì)工業(yè)生產(chǎn)用菌種，可通過基因工程手段，從遺傳層面提高菌種的穩(wěn)定性。
六、總結(jié)
菌種的“退化 - 復(fù)壯”是微生物應(yīng)用中的核心矛盾：退化的本質(zhì)是遺傳變異與環(huán)境選擇的共同結(jié)果，復(fù)壯的核心是篩選優(yōu)良個(gè)體與強(qiáng)化性狀，而預(yù)防則是避免退化的根本策略。在實(shí)際應(yīng)用中，需結(jié)合菌種特性建立“檢測(cè) - 復(fù)壯 - 預(yù)防”的完整體系，才能長(zhǎng)期維持菌種的優(yōu)良性能，保障工業(yè)生產(chǎn)與科研的穩(wěn)定性。
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