乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基的通用制備方法及關(guān)鍵注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-11-21 09:25:43
一、核心制備步驟（以 1L 培養(yǎng)基為例）
1、原料稱量（精準(zhǔn)度直接影響培養(yǎng)效果）
根據(jù)目標(biāo)培養(yǎng)基配方（參考之前提到的 MRS、LBS 等），用電子天平稱量所有成分，例如 MRS 瓊脂（1L）：
蛋白胨 10.0g、牛肉浸粉 8.0g、酵母浸粉 4.0g
葡萄糖 20.0g、磷酸氫二鉀 2.0g、檸檬酸氫二銨 2.0g
乙酸鈉 5.0g、硫酸鎂 0.2g、硫酸錳 0.04g
吐溫 - 80 1.0mL（液體成分，直接量?。?、瓊脂 14.0g
2、溶解與攪拌（確保無(wú)沉淀，成分均勻）
將稱量好的固體原料全部放入 1L 燒杯中，加入約 900mL 去離子水（或蒸餾水，避免雜質(zhì)影響）。
置于磁力攪拌器上，低速攪拌，同時(shí)用酒精燈小火加熱（或隔水加熱），直至瓊脂完全融化、所有成分溶解（溶液呈透明狀，無(wú)顆粒或沉淀）。
加熱時(shí)需不斷攪拌，防止瓊脂粘鍋燒焦；避免煮沸過(guò)度（高溫可能破壞營(yíng)養(yǎng)成分，如酵母浸粉中的維生素）。
3、補(bǔ)加水與調(diào)節(jié) pH 值（關(guān)鍵步驟，適配乳酸桿菌酸性生長(zhǎng)環(huán)境）
培養(yǎng)基冷卻至 40-50℃（不燙手）后，補(bǔ)充去離子水至 1000mL（加熱過(guò)程中水分會(huì)蒸發(fā)，需補(bǔ)至設(shè)定體積）。
用 pH 計(jì)測(cè)量 pH 值，根據(jù)配方要求調(diào)節(jié)（多數(shù)乳酸桿菌培養(yǎng)基 pH 為 5.5-6.8，如 LBS 為 5.5±0.2，MRS 為 6.5±0.2）：
pH 偏高：滴加 1mol/L 鹽酸溶液，邊滴加邊攪拌，直至達(dá)標(biāo)；
pH 偏低：滴加 1mol/L 氫氧化鈉溶液，同理調(diào)節(jié)。
調(diào)節(jié)后需再次攪拌均勻，重新測(cè)量 pH，確保誤差在 ±0.2 內(nèi)。
4、分裝與滅菌（無(wú)菌是核心，避免雜菌污染）
將調(diào)節(jié)好的培養(yǎng)基分裝至錐形瓶中（分裝量不超過(guò)錐形瓶容積的 1/2，預(yù)留滅菌時(shí)的膨脹空間），瓶口用雙層紗布 + 牛皮紙包扎（或用無(wú)菌硅膠塞密封）。
采用高壓蒸汽滅菌法：121℃、103.4kPa（1.05kg/cm²），滅菌 15-20 分鐘（殺滅所有微生物，包括芽孢）。
注意：滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)破壞營(yíng)養(yǎng)成分，過(guò)短則滅菌不徹底；滅菌后自然排氣，避免壓力驟降導(dǎo)致培養(yǎng)基暴沸。
5、冷卻與倒平板（避免凝固或污染）
滅菌后的培養(yǎng)基取出，在超凈工作臺(tái)內(nèi)冷卻至 50-60℃（手感不燙手，避免溫度過(guò)高殺死后續(xù)接種的菌種，或過(guò)低導(dǎo)致瓊脂凝固無(wú)法倒板）。
若需添加抗生素等選擇性成分（如抑制雜菌的萬(wàn)古霉素），需在培養(yǎng)基冷卻至 50℃左右時(shí)加入（高溫會(huì)破壞抗生素活性），快速攪拌均勻。
打開(kāi)培養(yǎng)皿（無(wú)菌操作，避免手接觸皿蓋內(nèi)側(cè)和皿底），將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿約 15-20mL（厚度均勻，覆蓋皿底即可）。
倒完后，水平放置培養(yǎng)皿，待培養(yǎng)基自然凝固（約 30 分鐘，避免晃動(dòng)導(dǎo)致表面不平整）。
6、無(wú)菌檢驗(yàn)與保存（確保培養(yǎng)基可用）
凝固后的平板，倒置放入 37℃恒溫培養(yǎng)箱中，空白培養(yǎng) 24-48 小時(shí)（檢測(cè)是否滅菌徹底，若平板上無(wú)雜菌菌落，則合格）。
合格的平板可密封后，4℃冷藏保存（避免陽(yáng)光直射），1 周內(nèi)使用完畢（存放過(guò)久會(huì)導(dǎo)致水分流失、營(yíng)養(yǎng)成分降解）。
二、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
原料質(zhì)量：乳酸桿菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求高，需使用優(yōu)質(zhì)蛋白胨、酵母浸粉（避免過(guò)期或變質(zhì)原料）；葡萄糖需用無(wú)水葡萄糖，避免結(jié)塊。
無(wú)菌操作：從分裝、滅菌后開(kāi)蓋到倒平板，全程在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，操作時(shí)戴無(wú)菌手套、口罩，避免空氣中雜菌污染。
瓊脂融化：必須確保瓊脂完全融化，否則凝固后會(huì)有硬塊，影響平板平整度和菌種生長(zhǎng)。
pH 適配性：乳酸桿菌為兼性厭氧菌，偏好酸性環(huán)境，pH 過(guò)高會(huì)抑制生長(zhǎng)，過(guò)低可能導(dǎo)致菌種死亡，需嚴(yán)格按配方調(diào)節(jié)。
特殊添加物：若用于選擇性分離（如
LBS 瓊脂），無(wú)需額外添加抑制劑（配方中已含乙酸鈉等抑菌成分）；若需強(qiáng)化分離，可在冷卻后添加 0.05g/L 萬(wàn)古霉素（抑制革蘭氏陽(yáng)性雜菌）。
三、常見(jiàn)問(wèn)題排查
平板凝固后表面有水珠：倒板后未倒置冷卻，或培養(yǎng)箱濕度太高，可倒置于 37℃烘干 1-2 小時(shí)再使用。
菌種不生長(zhǎng)：可能是 pH 調(diào)節(jié)不當(dāng)、滅菌時(shí)營(yíng)養(yǎng)成分破壞（如加熱過(guò)度），或原料過(guò)期，需逐一排查。
雜菌污染嚴(yán)重：滅菌不徹底或操作過(guò)程污染，需重新滅菌，嚴(yán)格無(wú)菌操作。
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