微生物實驗中接菌后平板上無菌生長的原因分析與排查！
小楊 / 2025-06-27 09:22:27
百歐博偉生物：實驗中遇到平板無菌生長的問題，是微生物實驗中非常常見的現(xiàn)象，只要系統(tǒng)排查就能找到原因。下面詳細分析一下可能的原因及解決方法。
一、菌種/接種物本身的問題 (這是最常見的原因之一)
1、菌種無活性/死亡:
保存不當: 菌種保存時間過長、保存溫度不合適（如應冷凍的放冷藏）、反復凍融、凍干菌種復蘇不當。
傳代過多: 菌種連續(xù)傳代次數(shù)過多，導致活力下降或變異。
污染或競爭: 原始菌種被雜菌污染，目標菌被抑制；或者菌種老化死亡。
處理不當: 接種前對菌種進行了不當處理（如高溫、強酸強堿、消毒劑接觸、劇烈震蕩、離心速度過大等）。
2、接種物濃度過低:
取菌量太少，或稀釋過度，導致平板上接種的活菌數(shù)量低于檢測限。
菌懸液未混勻，取到的部分不含或含很少菌體。
3、使用了錯誤的菌種:
誤用了非活菌（如滅活菌苗、死菌懸液）。
標簽錯誤，接種的并非目標菌種。
4、接種物未正確準備:
凍干菌種未按規(guī)定程序復蘇活化。
從甘油管或斜面取菌時未充分刮取菌苔。
二、培養(yǎng)基的問題
1、培養(yǎng)基成分不適宜:
培養(yǎng)基配方錯誤，缺乏目標菌生長必需的營養(yǎng)物質(zhì)（碳源、氮源、生長因子、無機鹽等）。
使用了選擇性培養(yǎng)基，其含有的抑制劑（如抗生素、染料、膽鹽、高鹽等）恰好抑制或殺死了目標菌。
pH值不適宜：培養(yǎng)基滅菌后pH值偏離目標菌最適范圍過多。
2、培養(yǎng)基失效:
培養(yǎng)基過期。
配制后儲存時間過長或條件不當（如未冷藏、光照）導致成分降解或脫水。
反復加熱熔化瓊脂導致營養(yǎng)成分破壞。
3、培養(yǎng)基制備或滅菌不當:
滅菌不徹底：存在抑制目標菌生長的殘留消毒劑或污染物產(chǎn)生的毒素。
過熱破壞: 高壓滅菌溫度過高、時間過長，或倒平板時培養(yǎng)基溫度過高（燙死接種物），特別是對熱敏感的菌種。
瓊脂濃度過高：影響菌的擴散和生長。
未充分溶解或混勻：營養(yǎng)成分分布不均。
4、未進行無菌測試: 培養(yǎng)基在接種前未進行無菌測試（空白培養(yǎng)），可能自身就無菌或含抑制劑。
三、接種操作的問題
1、未真正接到菌:
接種環(huán)/針/槍頭未接觸到菌種（如刮取斜面時沒碰到菌苔，或取液體培養(yǎng)物時未插入液面下）。
接種環(huán)灼燒后未充分冷卻，燙死了待接的菌。
涂布時涂布棒未冷卻或用力過大將菌壓入瓊脂內(nèi)甚至壓死。
2、接種量損失:
劃線時第一區(qū)劃得太重或太多，大部分菌都留在第一區(qū)，后面區(qū)域無菌或菌極少。
傾注法混勻時瓊脂溫度過高燙死菌，或搖動過于劇烈產(chǎn)生氣泡影響觀察（但通常仍有菌生長）。
涂布時液體未吸收，菌懸液聚集在局部，或被涂布棒帶出平板外。
3、污染導致抑制: 接種操作過程中引入的雜菌（如操作環(huán)境不潔、超凈臺/生物安全柜失效、操作者不熟練）過度生長，抑制了目標菌的生長（可能看到雜菌菌落，但無目標菌落）。
四、培養(yǎng)條件的問題
1、溫度不適宜: 培養(yǎng)箱溫度設置錯誤、溫度不均勻、溫度計不準、培養(yǎng)過程中斷電或開門頻繁導致溫度波動過大，偏離目標菌的最適生長溫度。
2、氣體條件不適宜:
需氧菌: 培養(yǎng)容器（如厭氧罐、氣密袋）未提供足夠氧氣；培養(yǎng)箱/罐內(nèi)濕度過高導致冷凝水淹沒平板表面，阻隔氧氣。
厭氧菌: 未能創(chuàng)造有效的厭氧環(huán)境（厭氧罐/袋未正確抽氣充氣、厭氧指示劑未顯示厭氧狀態(tài)、催化劑失效、密封不嚴漏氣）；培養(yǎng)基中未添加還原劑。
微需氧菌/CO2依賴菌: 未提供所需的特殊氣體環(huán)境（如5-10% CO2）。
3、濕度不足: 培養(yǎng)箱內(nèi)濕度過低，導致平板內(nèi)培養(yǎng)基過早干燥脫水，菌無法生長（尤其是靠近邊緣部分）。培養(yǎng)時間過長時更易發(fā)生。
4、培養(yǎng)時間不足: 某些菌種生長緩慢（如
分枝桿菌、某些真菌），需要更長的培養(yǎng)時間（數(shù)天甚至數(shù)周）才能形成肉眼可見的菌落。在預期時間內(nèi)觀察可能看不到生長。
5、光照: 某些對光敏感的菌種在不當光照條件下生長受抑制（相對少見）。
五、其他原因
1、平板污染: 平板在儲存或操作過程中被意外滅菌或污染了殺菌劑。
2、觀察錯誤:
菌落非常微小、透明或與培養(yǎng)基顏色相近，肉眼難以辨別（需仔細檢查或借助放大鏡）。
菌落生長在瓊脂內(nèi)部（穿刺接種時常見）或平板底部（倒置培養(yǎng)時），未從表面觀察。
誤將沉淀、氣泡或培養(yǎng)基雜質(zhì)當作無菌生長。
3、目標菌的特性: 某些菌在特定條件下（如處于活的非可培養(yǎng)狀態(tài)）無法在標準培養(yǎng)基上形成菌落。
如何排查和解決？
1、確認菌種活性:
同時接種另一種已知生長良好的非選擇性培養(yǎng)基。如果該平板上也不長，則問題很可能在菌種本身或接種操作。
將原始菌種或接種物進行革蘭氏染色鏡檢，觀察是否有菌體存在（即使死的也能看到）。如有菌體但平板上不長，說明菌可能死了或培養(yǎng)基/條件不合適。
檢查菌種來源、保存條件和記錄。
2、確認培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件:
設置培養(yǎng)基無菌測試對照: 未接種的同一批平板（或斜面/液體）放在相同條件下培養(yǎng)，應無菌生長。若對照長菌，說明培養(yǎng)基滅菌不徹底或操作污染嚴重。
設置陽性對照: 使用已知活性良好的同種或類似菌株（最好是標準菌株），在同一批培養(yǎng)基、相同條件下接種培養(yǎng)。如果陽性對照生長良好，說明培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件基本沒問題，問題在特定菌種或接種物。如果陽性對照也不長，則問題在培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件。
仔細核對培養(yǎng)基配方和制備記錄。
檢查培養(yǎng)箱: 用經(jīng)過校準的溫度計多點驗證箱內(nèi)實際溫度（尤其是平板放置的位置）。檢查濕度（必要時放置水盤）。檢查氣體環(huán)境（CO2濃度、厭氧指示劑狀態(tài)）。
延長培養(yǎng)時間: 對于生長緩慢的菌種，延長培養(yǎng)時間并在不同時間點觀察。
3、審視接種操作:
確保接種工具充分滅菌并冷卻。
確保取到了菌（肉眼觀察接種環(huán)/針上是否有菌苔或渾濁）。
規(guī)范操作（劃線法、涂布法、傾注法），避免接種量損失。
在超凈臺/生物安全柜內(nèi)規(guī)范操作，減少污染風險。
4、系統(tǒng)性地排除: 從菌種開始，逐步檢查接種物準備、培養(yǎng)基選擇與制備、接種操作、培養(yǎng)條件設定等每一步驟。記錄所有操作細節(jié)，便于回溯分析。
總之，平板無菌生長是一個多因素導致的結(jié)果。最有效的策略是設置嚴格的對照實驗（無菌對照、陽性對照），并系統(tǒng)地檢查菌種、培養(yǎng)基、操作和培養(yǎng)條件這四個關鍵環(huán)節(jié)。
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