細(xì)胞培養(yǎng)方法之傳代培養(yǎng)操作步驟與實(shí)驗(yàn)技巧及注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-06-12 09:55:09
百歐博偉生物：細(xì)胞培養(yǎng)是生物醫(yī)學(xué)研究中最基礎(chǔ)也是最重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。它涉及在體外模擬體內(nèi)環(huán)境，使細(xì)胞在人工條件下生長、增殖和維持。傳代培養(yǎng)是當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)容器中生長至一定密度時(shí)，將其分瓶接種，以提供更多生長空間并維持細(xì)胞活性的過程。
一、細(xì)胞培養(yǎng)基本要素與方法
1、無菌環(huán)境：
生物安全柜 (BSC)：所有開放操作必須在經(jīng)認(rèn)證的BSC中進(jìn)行，提供無菌工作區(qū)并保護(hù)操作者和環(huán)境。
無菌技術(shù)：嚴(yán)格遵循無菌操作規(guī)程：穿戴實(shí)驗(yàn)服、手套、口罩；試劑、耗材滅菌；避免開口暴露過久；勤用75%酒精消毒手、臺(tái)面和物品表面；使用無菌槍頭、移液管。
培養(yǎng)基和試劑：必須無菌（通常購買已滅菌產(chǎn)品或自行過濾除菌）。
2、培養(yǎng)環(huán)境模擬：
溫度：絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞在 37°C 下培養(yǎng)。
氣體環(huán)境：大多數(shù)細(xì)胞需要 5% CO? 來維持培養(yǎng)基的pH值（通常在7.2-7.4）。使用帶有CO?控制的恒溫培養(yǎng)箱。
濕度：培養(yǎng)箱需維持高濕度（>95%），防止培養(yǎng)基蒸發(fā)。通常使用無菌水盤。
培養(yǎng)基：
基礎(chǔ)培養(yǎng)基：提供基本營養(yǎng)物質(zhì)（氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、葡萄糖）。
血清：最常用的是胎牛血清，提供生長因子、激素、粘附因子和營養(yǎng)物質(zhì)。濃度通常為5-20%。
添加劑：抗生素（如鏈霉素）和抗真菌劑（如兩性霉素B或制霉菌素）用于防止污染（但無法替代無菌操作）；有時(shí)需添加L-谷氨酰胺（細(xì)胞重要能量來源，不穩(wěn)定，需定期補(bǔ)充）、非必需氨基酸、HEPES緩沖液（pH穩(wěn)定）等。
培養(yǎng)容器：根據(jù)不同需求選擇：培養(yǎng)瓶（T25, T75, T175）、培養(yǎng)皿（35mm, 60mm, 100mm）、多孔板（6孔，12孔，24孔，96孔等）。材質(zhì)通常是經(jīng)表面處理的聚苯乙烯塑料，利于細(xì)胞貼附。
3、細(xì)胞類型：
貼壁細(xì)胞：需要附著在固體表面生長。傳代時(shí)需用酶（如胰蛋白酶）消化使其從培養(yǎng)皿/瓶底脫落。
懸浮細(xì)胞：在培養(yǎng)基中自由漂浮生長。傳代時(shí)直接稀釋或離心收集即可。
二、貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)操作步驟（以常用胰蛋白酶消化法為例）
（一）準(zhǔn)備工作：
1、預(yù)熱：將所需體積的完全培養(yǎng)基（含血清）、PBS（磷酸鹽緩沖液，無鈣鎂）、胰蛋白酶-EDTA溶液置于37°C水浴或培養(yǎng)箱中預(yù)熱15-30分鐘。冷的溶液會(huì)降低消化效率并刺激細(xì)胞。
2、生物安全柜準(zhǔn)備：開啟BSC通風(fēng)和紫外燈至少15-30分鐘。關(guān)閉紫外燈，開啟照明和風(fēng)機(jī)。用75%酒精徹底擦拭內(nèi)表面。準(zhǔn)備好無菌移液器、槍頭、廢液缸、離心管、新培養(yǎng)瓶/皿、標(biāo)記筆。
3、觀察細(xì)胞：將原培養(yǎng)瓶/皿從培養(yǎng)箱取出，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)和密度。細(xì)胞應(yīng)處于對數(shù)生長期后期（融合度約80-90%），形態(tài)健康，無污染跡象（渾濁、漂浮物、菌絲、異常pH變化）。這是傳代的最佳時(shí)機(jī)。
（二）操作步驟：
1、移除舊培養(yǎng)基：
小心地將含有舊培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶/皿轉(zhuǎn)移到BSC內(nèi)。
用無菌移液管或真空泵（帶無菌吸頭）輕柔地吸棄舊培養(yǎng)基。避免觸及瓶底細(xì)胞層。
2、PBS洗滌：
向培養(yǎng)瓶/皿中加入適量預(yù)熱的無菌PBS（體積通常能覆蓋細(xì)胞層即可，如T25瓶約3-5ml）。
輕輕晃動(dòng)或傾斜容器，使PBS潤洗整個(gè)細(xì)胞生長面。
吸棄PBS。此步驟旨在去除殘留的血清（血清含有胰蛋白酶抑制劑），并洗去死細(xì)胞碎片。
3、加入胰蛋白酶-EDTA：
加入適量預(yù)熱的胰蛋白酶-EDTA溶液（覆蓋細(xì)胞層即可，如T25瓶約1-2ml）。確保溶液均勻覆蓋細(xì)胞。
輕輕晃動(dòng)容器，使溶液均勻分布。
消化：將培養(yǎng)瓶/皿放回37°C培養(yǎng)箱中，或置于BSC內(nèi)室溫下（37°C效果更快更均勻）。消化時(shí)間需密切觀察（通常30秒-5分鐘，取決于細(xì)胞類型和胰酶活性），切勿過度消化。
觀察判斷：顯微鏡下觀察或肉眼傾斜觀察。當(dāng)大部分細(xì)胞變圓、邊緣發(fā)亮、有脫落趨勢（輕拍瓶壁可見“沙霧”狀脫落）時(shí)，立即終止消化。切勿等到所有細(xì)胞完全脫落！
4、終止消化：
迅速將培養(yǎng)瓶/皿移回BSC。
加入含血清的完全培養(yǎng)基（體積通常是胰酶體積的2-5倍，如T25瓶加入4-8ml）。血清中的抑制劑能快速中和胰蛋白酶活性。
用移液管輕柔吹打細(xì)胞層表面（沿瓶壁或皿底不同方向反復(fù)吹吸數(shù)次），使貼壁細(xì)胞完全脫離并分散成單細(xì)胞懸液。吹打動(dòng)作要輕柔，避免產(chǎn)生過多氣泡損傷細(xì)胞。
5、收集細(xì)胞懸液：
將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基（即細(xì)胞懸液）轉(zhuǎn)移至一個(gè)無菌的離心管中。
6、離心：
平衡離心管后，放入離心機(jī)。
以相對較低的轉(zhuǎn)速離心（通常1000-1200 rpm / 約150-200 g）5-10分鐘。目的是將細(xì)胞沉淀下來，去除含有胰酶和舊培養(yǎng)基的上清液。
7、重懸細(xì)胞：
離心結(jié)束后，小心取出離心管，避免擾動(dòng)沉淀。
用無菌移液管徹底吸棄上清液。
加入新鮮預(yù)熱的完全培養(yǎng)基（體積根據(jù)后續(xù)分瓶需求確定）。
用移液管輕柔吹打或反復(fù)抽吸（避免氣泡），使細(xì)胞沉淀完全、均勻地重懸成單細(xì)胞懸液。吹打次數(shù)不宜過多過猛。
8、細(xì)胞計(jì)數(shù)與活力檢測 (可選但推薦)：
取少量細(xì)胞懸液，用臺(tái)盼藍(lán)染色法或自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞活力（活細(xì)胞百分比）。
根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果調(diào)整最終接種密度。
9、分瓶接種：
根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求（擴(kuò)增或維持）和細(xì)胞類型，將計(jì)算好體積的細(xì)胞懸液加入新的、標(biāo)記好信息（細(xì)胞名稱、代次、日期、操作者）的培養(yǎng)瓶/皿中。
加入新鮮預(yù)熱的完全培養(yǎng)基至所需工作體積（如T25瓶通常8-10ml）。
輕柔晃動(dòng)或十字法（前后左右）晃動(dòng)容器，使細(xì)胞均勻分布。
10、培養(yǎng)：
蓋緊瓶蓋或蓋上皿蓋。
將新接種的培養(yǎng)瓶/皿小心放入37°C，5% CO?，飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中。
通常24小時(shí)后觀察細(xì)胞貼壁和生長情況。
三、懸浮細(xì)胞傳代培養(yǎng)操作步驟
懸浮細(xì)胞傳代相對簡單，無需消化步驟：
觀察細(xì)胞：同貼壁細(xì)胞。
收集細(xì)胞：將培養(yǎng)瓶/皿中的細(xì)胞懸液輕輕混勻，轉(zhuǎn)移至無菌離心管中。
離心：同貼壁細(xì)胞（1000-1200 rpm，5-10分鐘）。
移除上清：吸棄含有舊培養(yǎng)基的上清液。
重懸：加入適量新鮮預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，輕柔吹打重懸細(xì)胞。
計(jì)數(shù)與活力檢測 (可選但推薦)： 同貼壁細(xì)胞。
分瓶接種：根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，將所需體積的細(xì)胞懸液加入新的、標(biāo)記好的培養(yǎng)容器中，補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基至工作體積。
培養(yǎng)：同貼壁細(xì)胞。
關(guān)鍵注意事項(xiàng)：
無菌！無菌！無菌！這是細(xì)胞培養(yǎng)成功的首要前提。任何疏忽都可能導(dǎo)致污染（細(xì)菌、真菌、支原體），導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。
輕柔操作：吹打、離心、移液等動(dòng)作務(wù)必輕柔，避免機(jī)械損傷細(xì)胞。
嚴(yán)格控制消化時(shí)間：過度消化會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞。
環(huán)境穩(wěn)定：確保培養(yǎng)箱溫度、CO?濃度、濕度恒定。頻繁開關(guān)門會(huì)影響穩(wěn)定性。
定期觀察：每天或隔天觀察細(xì)胞形態(tài)、密度、培養(yǎng)基顏色（pH指示）及有無污染跡象。
及時(shí)傳代：細(xì)胞過密（100%融合或懸浮細(xì)胞密度過高）會(huì)導(dǎo)致接觸抑制、營養(yǎng)耗竭、代謝廢物積累，影響細(xì)胞狀態(tài)甚至死亡。不要在細(xì)胞長滿后才傳代。
記錄：詳細(xì)記錄細(xì)胞名稱、來源、代數(shù)、傳代日期、操作步驟、培養(yǎng)基批次、任何異常情況等。這對實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性和問題追蹤至關(guān)重要。
選擇合適的傳代比例/密度：根據(jù)細(xì)胞生長速度和實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定分瓶比例（如1:2, 1:3, 1:4, 1:10）或接種密度（如細(xì)胞數(shù)/cm² 或 細(xì)胞數(shù)/ml）。
血清批次：不同批次的血清質(zhì)量可能有差異。對于關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)，建議測試不同批次血清或使用同一批次血清。
定期檢測支原體：支原體污染非常普遍且難以察覺，會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。建議定期（如每1-2個(gè)月）進(jìn)行支原體檢測。
實(shí)驗(yàn)技巧：
預(yù)熱充分：確保所有接觸細(xì)胞的液體都預(yù)熱至37°C。
胰酶濃度與時(shí)間：摸索適合自己細(xì)胞系的最佳胰酶濃度和消化時(shí)間。有些細(xì)胞可能需要更低濃度或更短時(shí)間。
吹打技巧：吹打時(shí)槍頭抵住瓶壁或管壁，避免直接沖擊細(xì)胞沉淀。吹吸力度適中，次數(shù)以細(xì)胞分散均勻?yàn)闇?zhǔn)。
避免氣泡：劇烈吹打或移液容易產(chǎn)生氣泡，損傷細(xì)胞。
細(xì)胞計(jì)數(shù)：臺(tái)盼藍(lán)染色時(shí)，活細(xì)胞排斥染料不著色（透明），死細(xì)胞著藍(lán)色。計(jì)數(shù)應(yīng)在染色后幾分鐘內(nèi)完成。
凍存?zhèn)浞荩憾ㄆ趦龃娴痛鷶?shù)的健康細(xì)胞作為備份，防止因污染或意外丟失細(xì)胞株。
掌握細(xì)胞培養(yǎng)和傳代技術(shù)需要理論學(xué)習(xí)和大量的實(shí)踐操作。嚴(yán)格按照規(guī)程操作，注意細(xì)節(jié)，保持耐心和細(xì)心，是成功的關(guān)鍵。
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