ATCC細(xì)胞的冷凍保存及解凍復(fù)蘇的標(biāo)準(zhǔn)操作流程！
小楊 / 2025-05-23 09:36:53
一、細(xì)胞冷凍保存（凍存）方法
1、準(zhǔn)備工作
凍存液配制：含10% DMSO（二甲基亞砜）的細(xì)胞凍存培養(yǎng)基（常用配方：70%完全培養(yǎng)基 + 20%胎牛血清FBS + 10% DMSO），需新鮮配制并預(yù)冷（4℃）。
材料準(zhǔn)備：凍存管（標(biāo)記名稱、日期、代次）、程序降溫盒（或異丙醇凍存盒）、離心機(jī)、移液器、冰盒等。
2、操作步驟
細(xì)胞狀態(tài)確認(rèn)
凍存前確保細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活力>90%，無(wú)污染。
細(xì)胞收集
消化細(xì)胞（胰酶或其他消化液），用完全培養(yǎng)基終止消化，離心（1000 rpm，5分鐘），棄上清。
重懸細(xì)胞
用預(yù)冷的凍存液輕柔重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×10?~1×10? cells/mL（高密度可提高復(fù)蘇存活率）。
分裝凍存管
將細(xì)胞懸液分裝至凍存管（每管1~1.5 mL），避免氣泡，旋緊管蓋。
程序降溫
標(biāo)準(zhǔn)程序：4℃ 30分鐘 → -20℃ 2小時(shí) → -80℃過(guò)夜 → 轉(zhuǎn)移至液氮長(zhǎng)期保存（-196℃）。
替代方案：使用程序降溫盒直接放置于-80℃冰箱過(guò)夜，再轉(zhuǎn)移至液氮。
3、注意事項(xiàng)
DMSO有毒性，操作需快速以減少細(xì)胞暴露時(shí)間。
避免反復(fù)凍融，凍存管直接投入液氮時(shí)需密封良好，防止爆炸。
記錄凍存信息：細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期、存放位置等。
二、細(xì)胞解凍復(fù)蘇方法
1、準(zhǔn)備工作
預(yù)熱的完全培養(yǎng)基、水浴鍋（37℃）、離心機(jī)、培養(yǎng)瓶/皿、移液器。
2、操作步驟
快速解凍
從液氮中取出凍存管，立即放入37℃水浴，持續(xù)輕柔搖晃至完全融化（約1~2分鐘）。
稀釋與離心
將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含5~10 mL預(yù)熱的完全培養(yǎng)基的離心管中，輕柔混勻（稀釋DMSO毒性）。
離心（1000 rpm，5分鐘），棄上清。
重懸與接種
用新鮮完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種至培養(yǎng)器皿，輕搖均勻。
根據(jù)細(xì)胞類型調(diào)整接種密度（如貼壁細(xì)胞可按原培養(yǎng)密度的2倍接種）。
培養(yǎng)觀察
放入37℃、5% CO?培養(yǎng)箱，24小時(shí)后更換培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞和殘留DMSO。
觀察細(xì)胞貼壁、增殖及形態(tài)變化。
3、注意事項(xiàng)
解凍過(guò)程需快速，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于高濃度DMSO。
若細(xì)胞復(fù)蘇后存活率低，可嘗試增加接種密度或添加細(xì)胞保護(hù)劑。
嚴(yán)格無(wú)菌操作，水浴鍋需清潔或使用密封袋防止污染。
三、關(guān)鍵點(diǎn)總結(jié)
冷凍核心：緩慢降溫（防止冰晶損傷細(xì)胞膜） + 保護(hù)劑（DMSO或甘油）。
解凍核心：快速融解（減少DMSO毒性） + 及時(shí)稀釋。
存活率評(píng)估：復(fù)蘇后可通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力，正常應(yīng)>80%。
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