單細(xì)胞組織解離的實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-04-12 09:08:40
百歐博偉生物：以下是單細(xì)胞組織解離的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方法，適用于后續(xù)單細(xì)胞測(cè)序、流式細(xì)胞術(shù)或單細(xì)胞功能分析。實(shí)驗(yàn)步驟需根據(jù)具體組織類型（如肝臟、腦、腫瘤等）調(diào)整酶解條件。
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
1、試劑與耗材
組織保存液（如HBSS或PBS，含1% BSA或FBS，預(yù)冷至4℃）
組織解離酶（根據(jù)組織類型選擇，常用酶包括膠原酶IV、透明質(zhì)酸酶、DNase I、胰蛋白酶等）
紅細(xì)胞裂解液（如ACK lysing buffer，針對(duì)含血組織）
細(xì)胞篩（70 μm、40 μm尼龍濾網(wǎng)）
離心管、冰盒、鑷子、手術(shù)剪、培養(yǎng)皿（預(yù)冷）
臺(tái)盼藍(lán)或AO/PI染料（細(xì)胞活性檢測(cè)）
2、儀器
恒溫水浴搖床（37℃）
離心機(jī)（4℃預(yù)冷）
顯微鏡（評(píng)估細(xì)胞狀態(tài)）
生物安全柜（無(wú)菌操作）
3、安全措施
無(wú)菌操作（全程在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行）
戴手套、口罩，避免樣本污染
二、實(shí)驗(yàn)步驟
1、組織獲取與預(yù)處理
取材：快速獲取新鮮組織（<30分鐘），置于預(yù)冷的組織保存液中（4℃運(yùn)輸）。
清洗：用預(yù)冷PBS沖洗3次，去除血液和雜質(zhì)。
剪切：用無(wú)菌手術(shù)剪將組織剪成1-3 mm³小塊（越小越好，增加酶解效率）。
2、酶解消化
酶解液配制（以腫瘤組織為例，需根據(jù)組織硬度調(diào)整）：
HBSS + 膠原酶IV（1-2 mg/ml）
+ 透明質(zhì)酸酶（0.1-0.5 mg/ml）
+ DNase I（10-50 U/ml）
+ 2% FBS（抑制過(guò)度消化）
孵育：
將組織塊轉(zhuǎn)移至酶解液中（1 g組織/5-10 ml酶解液）。
37℃搖床孵育（轉(zhuǎn)速50-100 rpm，時(shí)間15-60分鐘，根據(jù)組織類型調(diào)整）。
每隔10分鐘輕吹打或用移液槍反復(fù)吹吸，加速解離。
3、終止消化與過(guò)濾
終止：加入含10% FBS的冷培養(yǎng)基終止反應(yīng)。
過(guò)濾：依次通過(guò)70 μm和40 μm細(xì)胞篩，去除未解離的團(tuán)塊。
離心：4℃ 300-500 ×g 離心5分鐘，棄上清。
4、紅細(xì)胞裂解（可選）
若組織含較多紅細(xì)胞（如脾臟、腫瘤）：
加入1-2 ml紅細(xì)胞裂解液（如ACK lysing buffer），冰上裂解2-5分鐘。
立即加入10倍體積PBS終止，離心后重懸。
5、細(xì)胞洗滌與評(píng)估
洗滌：用預(yù)冷PBS或含BSA的緩沖液洗滌2次。
細(xì)胞計(jì)數(shù)：用臺(tái)盼藍(lán)染色，顯微鏡或自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀評(píng)估活率（需>80%）。
分選前處理（如需要）：
使用Dead Cell Removal Kit去除死細(xì)胞。
標(biāo)記抗體（如抗CD45去除免疫細(xì)胞）。
三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
1、保持細(xì)胞活性：
全程低溫操作（除酶解步驟外）。
避免過(guò)度消化（可預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳時(shí)間）。
2、避免細(xì)胞結(jié)團(tuán)：
加入DNase I降解釋放的DNA。
輕柔吹吸，避免機(jī)械損傷。
3、組織特異性調(diào)整：
腦組織：需添加神經(jīng)保護(hù)劑（如BSA、抗氧化劑），縮短消化時(shí)間。
肝臟/胰腺：膠原酶濃度需提高至3-5 mg/ml。
實(shí)體瘤：可能需多步酶解（如先膠原酶后胰酶）。
四、常見問(wèn)題與解決
細(xì)胞活性低：減少消化時(shí)間或降低酶濃度；預(yù)冷所有試劑。
細(xì)胞結(jié)塊：增加DNase I濃度或過(guò)濾次數(shù)。
產(chǎn)量低：延長(zhǎng)消化時(shí)間或機(jī)械輔助（如gentleMACS解離儀）。
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