犬軟骨細(xì)胞常用永生化方法與操作流程及注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-03-28 09:12:02
犬軟骨細(xì)胞永生化是指通過基因工程手段使原代犬軟骨細(xì)胞突破復(fù)制衰老限制，獲得無限增殖能力，從而建立穩(wěn)定的細(xì)胞系。這在軟骨生物學(xué)研究、骨關(guān)節(jié)炎模型構(gòu)建、藥物篩選等領(lǐng)域具有重要意義。以下是相關(guān)技術(shù)要點(diǎn)和注意事項(xiàng)：
一、常用永生化方法
1、SV40大T抗原
原理：通過逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒載體導(dǎo)入SV40病毒Large T抗原基因，抑制p53和Rb蛋白，解除細(xì)胞周期阻滯。
特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化效率高（約70%），但需注意潛在致瘤性
2、hTERT端粒酶激活
方法：轉(zhuǎn)染人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因，維持端粒長度
優(yōu)勢：遺傳穩(wěn)定性較好，致瘤風(fēng)險(xiǎn)相對較低
3、癌基因組合
常用組合：c-Myc + Ras + SV40 T抗原
效率：可獲得高增殖活性，但需嚴(yán)格生物安全控制
4、CRISPR/dCas9表觀調(diào)控
新技術(shù)：通過基因編輯激活內(nèi)源性端粒酶表達(dá)
優(yōu)勢：避免外源基因插入，更接近天然狀態(tài)
二、操作流程示例（以慢病毒載體為例）
1、原代細(xì)胞分離：從幼犬關(guān)節(jié)軟骨中通過II型膠原酶消化獲得
2、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)：MOI=5-10的SV40 T抗原重組慢病毒感染P2代細(xì)胞
3、篩選：加入嘌呤霉素（2μg/mL）持續(xù)篩選2周
4、單克隆化：有限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞系
5、驗(yàn)證：
增殖曲線（PD>50代）
端粒酶活性檢測（TRAP法）
核型分析（維持犬2n=78染色體）
軟骨表型檢測（II型膠原、Aggrecan免疫熒光）
三、功能維持關(guān)鍵
1、3D培養(yǎng)驗(yàn)證：在藻酸鹽或瓊脂糖中應(yīng)保持球形生長特性
2、基質(zhì)分泌能力：GAG含量應(yīng)≥15μg/10^6 cells（比色法）
3、力學(xué)響應(yīng)：對流體剪切力（5-15 dyn/cm²）保持代謝應(yīng)答
四、典型應(yīng)用案例
1、骨關(guān)節(jié)炎模型：永生化細(xì)胞經(jīng)IL-1β刺激后，MMP-13表達(dá)上調(diào)5-8倍
2、基因治療研究：作為AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率測試模型（感染率可達(dá)90%）
3、支架材料測試：與PLGA支架共培養(yǎng)21天后形成類軟骨組織（壓縮模量≥0.4MPa）
五、注意事項(xiàng)
1、需定期檢測支原體污染（建議每月用PCR法檢測）
2、傳代密度應(yīng)保持30-80%匯合度，避免過度融合導(dǎo)致去分化
3、推薦使用含10% FBS + 1% ITS + 50μg/mL抗壞血酸的專用培養(yǎng)基
4、商業(yè)化資源：ATCC現(xiàn)有犬軟骨細(xì)胞系（如C2-10）可供對比研究
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司的
微生物菌種查詢網(wǎng)提供微生物菌種保藏、測序、購買等服務(wù),是中國微生物菌種保藏中心的服務(wù)平臺，并且是集微生物菌種、菌種,ATCC菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基為一體的大型微生物查詢類網(wǎng)站，自設(shè)設(shè)備及技術(shù)的微生物菌種保藏中心！歡迎廣大客戶來詢！
下載附件
上一篇：斯氏芽孢桿菌的基本特征與生態(tài)分布及應(yīng)用領(lǐng)域！
下一篇：瓊脂包埋法的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)流程與注意事項(xiàng)及應(yīng)用場景！